李志強(qiáng),何　德,李翠新

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

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基于兼并引物的PCR擴(kuò)增特定基因的效果比較

李志強(qiáng),何德,李翠新*

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

摘要：根據(jù)NCBI上的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因序列設(shè)計(jì)兼并引物，采用常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR三種方法擴(kuò)增糙皮側(cè)耳和阿魏側(cè)耳的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ部分基因序列，比較三種方法擴(kuò)增效果的特異性、靈敏度.結(jié)果表明，巢式PCR的靈敏度和特異性都優(yōu)于常規(guī)PCR和降落PCR，并且巢式PCR的靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍以上，更加適合兼并引物擴(kuò)增.這對(duì)利用兼并引物獲取特異基因具有指導(dǎo)意義.

關(guān)鍵詞：兼并引物；常規(guī)PCR；降落PCR；巢式PCR

表1　供試菌種名稱及來源

20世紀(jì)90年代后，隨著分生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，PCR方法也得到廣泛的應(yīng)用.目前，常用的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR、免疫捕獲PCR、熒光定量PCR、Long-PCR等一系列PCR方法.降落PCR(Touchdown PCR)技術(shù)是Don等[1]1991年提出的，它是將退火溫度在多次循環(huán)中逐步降低的PCR技術(shù)，能夠很好的彌補(bǔ)兼并引物最佳退火溫度難以確定的缺點(diǎn).巢式PCR在分子生物學(xué)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[2-4]，它是在普通基PCR礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)PCR技術(shù)，它的基本原理是通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性DNA片段，第二對(duì)引物的功能是特異性擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段.

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是真核生物代謝過程中重要的核酶，能夠讓一條完整的雙鏈DNA穿過它的活性區(qū)域缺口后，完成雙鏈DNA的解旋[5].本試驗(yàn)基于RT-PCR基本原理，利用設(shè)計(jì)的兼并引物，采用常規(guī)PCR、降落PCR以及巢式PCR方法對(duì)側(cè)耳屬(Pleurotus)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并比較三者之間的特異性及靈敏度，以期為利用兼并引物進(jìn)行基因擴(kuò)增和獲取提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株為側(cè)耳屬的2個(gè)種，菌株來源及名稱見表1.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成搜索并獲取GenBank已經(jīng)發(fā)表的11種側(cè)耳屬菌株的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因序列(金頂側(cè)耳，登錄號(hào)為EU430628.1；哥倫比亞側(cè)耳，登錄號(hào)為EU430631.1；黑杏鮑菇，EU430633.1；菌核側(cè)耳，EU430630.1；扇形側(cè)耳，EU430639.1；桃紅側(cè)耳，EU430634.1；白靈菇，EU430636.1；蓋囊側(cè)耳，EU430637.1；紅平菇，EU430638.1；鮑魚菇，EU430625.1；黃白側(cè)耳，EU430635.1)以及亞側(cè)耳菌株(元蘑EU430627.1)和離褶傘屬菌株(真姬離褶傘，EU430632.1)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ部分基因序列.通過Clustal對(duì)齊后，經(jīng)過Oligo6軟件分析后根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)兩對(duì)簡(jiǎn)并引物.TOP1：GGCBAARTTCAAGGCYGAC；TOP2：CTCCAGCCHGTKCCRATR；TOP3：GATCATGACNGATCARGATCA；TOP4：GCGACYTTRATTTCCTTCT(引物由華大生物科技有限公司合成).

1.2.2總RNA提取總RNA提取采用TRIzon Reagent總RNA提取試劑盒(北京康為生物科技公司)，提取后的RNA電泳檢測(cè)后放置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3三種PCR反應(yīng)特異性比較

1)cDNA第一鏈的獲取

將提取到的總RNA2μL，用逆轉(zhuǎn)錄酶RevertAidTM H Minus(Fermantas 公司)1μL，oligodT(10mM) 2μL，總反應(yīng)體系20μL反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA.

2)常規(guī)PCR

取2μL已經(jīng)獲得的第一鏈cDNA模板2μL，用TOP1和TOP2，TOP 3和TOP 4(濃度均為10mM)各2μL分別進(jìn)行2次常規(guī)PCR擴(kuò)增.加入Taq MasterMix (北京康為生物科技)12.5μL，反應(yīng)總體積都為25μL在PCR儀(BIO-RAD C1000 Thermal Cyclers)中進(jìn)行常規(guī)PCR.TOP1和TOP2引物擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s；72℃延伸30s，循環(huán)33次， 72℃終延伸5min.TOP3和TOP4擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，33次循環(huán)；最后72℃終延伸5min.

3)降落PCR

降落PCR利用cDNA第一鏈作為模版，TOP3作為上游引物，TOP4作為下游引物，反應(yīng)時(shí)退火溫度從58℃每循環(huán)降低1℃，直至52℃后，再按照上面的常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行27輪循環(huán).

4)巢式PCR

巢式PCR的第一輪擴(kuò)增取cDNA2μL，上下游引物TOP 1和TOP 2各1μL，加Taq Mix 12.5μL補(bǔ)至25μL總反應(yīng)體系.PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行33次循環(huán).

對(duì)巢式PCR第一輪產(chǎn)物稀釋50倍后取2μL做第二輪PCR模板，加入內(nèi)側(cè)引物TOP3和TOP4各2μL，進(jìn)行25μL反應(yīng)體系擴(kuò)增，用上述常規(guī)PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

5)凝膠電泳檢測(cè)

對(duì)上述三種PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，將常規(guī)PCR中TOP3和TOP4擴(kuò)增產(chǎn)物與降落PCR和巢式PCR進(jìn)行產(chǎn)物特異性比較.

1.2.4三種PCR反應(yīng)的靈敏度比較對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物做10、102、103、104、105倍的濃度梯度稀釋后取2μL作為常規(guī)PCR、降落PCR以及巢式PCR第一輪反應(yīng)的模版，常規(guī)PCR運(yùn)用TOP3和TOP4作為引物，運(yùn)用上面三種PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，比較其靈敏度.

1.2.5目的條帶片段克隆檢測(cè)對(duì)目的條帶片段進(jìn)行膠回收，將回收片段連接到PJET1.2/blunt vector(Fermantas 公司)上，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上篩選克隆菌落，挑選單克隆菌落，接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h.將培養(yǎng)后菌液取20μL在沸水中煮沸10～15min，取1μL煮沸后的菌液做PCR反應(yīng)的模版，進(jìn)行菌液PCR.

菌液PCR采用PJET1.2通用引物各0.3μL，Taq MasterMix(康為生物科技)5μL，PCR水3.4μL，總反應(yīng)體積10μL進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行25輪循環(huán).

1.2.6測(cè)序和生物信息學(xué)分析將菌液PCR的產(chǎn)物取4μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定質(zhì)粒載體中導(dǎo)入的片段大小是否與目的片段大小相同.將檢測(cè)出的含有目的條帶片段大小對(duì)應(yīng)的菌液1mL送樣進(jìn)行序列測(cè)定(測(cè)序公司為華大科技有限公司).利用NCBI中的Blastp搜索軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行分析鑒定.

注：M:marker； 1：糙皮側(cè)耳；2：阿魏菇圖1　總RNA提取電泳圖Fig.1　Total RNA extraction from strains

注：M：DL2000marker； 1：糙皮側(cè)耳； 2：阿魏菇圖2　巢式PCR第一輪擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　The first round of reaction products by nested PCR

注：1，2，3道： 糙皮側(cè)耳，5，6，7道：阿魏菇，4：陰性對(duì)照；1和5是常規(guī)PCR，2和6是降落PCR，3和7是巢式PCR圖3　三種PCR方法擴(kuò)增特異性比較Fig.3　The comparison of specificity of three methods

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA提取結(jié)果檢測(cè)

提取的總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1.總RNA條帶清晰，泳道無(wú)背景彌散，5S條帶較弱，28S條帶與18S條帶亮度接近2∶1.紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的值介于1.8至2.0之間，說明RNA提取質(zhì)量較高,適于RT-PCR實(shí)驗(yàn).

2.2PCR特異性比較

由TOP1和TOP2引物進(jìn)行的常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示.供試菌株糙皮側(cè)耳和阿魏菇通過TOP1和TOP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得出的條帶呈現(xiàn)彌散狀，無(wú)相應(yīng)的1400bp大小的目的條帶，PCR結(jié)果特異性差.所以利用TOP1和TOP2引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增無(wú)法獲得特異性目的條帶.

利用TOP3和TOP4引物進(jìn)行常規(guī)PCR后與降落PCR和巢式PCR結(jié)果進(jìn)行特異性比較，如圖3所示.片段大小與目的片段大小一致為600bp左右，糙皮側(cè)耳用三種PCR體系都可以成果擴(kuò)增出特異性片段，阿魏菇只有降落PCR和巢式PCR有特異性條帶，并且巢式PCR擴(kuò)增后的條帶要更加清晰.

圖3中可以看出對(duì)于兼并引物來說巢式PCR的特異性要高于常規(guī)PCR和普通降落PCR，并且巢式PCR對(duì)于不同菌種的擴(kuò)增效果穩(wěn)定性更好.

2.3　常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR的靈敏度檢測(cè)

三種PCR反應(yīng)靈敏度結(jié)果如圖4所示.檢測(cè)的條帶大小為600bp為目的條帶，常規(guī)PCR的靈敏度為10倍至102之間，降落PCR在模板稀釋103后條帶才變?nèi)酰彩絇CR在模板稀釋105后仍然能夠檢測(cè)出明顯的條帶.表明巢式PCR靈敏度能夠達(dá)到普通PCR的100倍.

2.4　產(chǎn)物序列檢測(cè)

對(duì)巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆檢測(cè)，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，檢測(cè)如圖5.菌液PCR電泳檢測(cè)條帶為預(yù)期600bp大小.

將克隆后菌液進(jìn)行測(cè)序獲取核苷酸序列，在NCBI上BLAST搜索，結(jié)果顯示Query coverage為40%～43%； Max ident值為94%～97%；E value值為0，搜索的結(jié)果擊中的是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ序列，且得分高的均為側(cè)耳的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II，沒有擊中其他類型的基因序列，表明三種PCR擴(kuò)增條帶為所需的特異性目的條帶.

3　結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)三種PCR方法擴(kuò)增側(cè)耳屬拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ序列的特異性和靈敏度進(jìn)行分析比較，得出常規(guī)PCR和降落PCR在通過兼并引物擴(kuò)增目的序列時(shí)特異性和對(duì)屬內(nèi)不同菌種擴(kuò)增的穩(wěn)定性不能得到很好的保證，而巢式PCR的特異性效果明顯.降落PCR在起始退火溫度較高的時(shí)候能夠特異性的擴(kuò)增，即使退火溫度最終降到非特異性雜交的Tm值時(shí)，但此時(shí)目的產(chǎn)物已經(jīng)開始幾何擴(kuò)增，在剩余的循環(huán)中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量[6].王天云在利用改良的降落PCR方法擴(kuò)增鹽藻基因時(shí)，取得了不錯(cuò)的效果[7].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了降落PCR在一定程度上可以提高PCR擴(kuò)增的特異性與靈敏性，但是與巢式PCR的效果相比還存在一定差距.

在模板定量研究中發(fā)現(xiàn)巢式PCR在利用兼并引物擴(kuò)增目的序列時(shí)靈敏度高于常規(guī)PCR和降落PCR并且是常規(guī)PCR靈敏度的100倍.雖然與李文杰[8]等檢測(cè)的巢式PCR是常規(guī)PCR靈敏度1000倍的結(jié)果有差

注：M：DL2000marker；1～5：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的常規(guī)PCR；6～10：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的降落PCR；11-15：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的巢式PCR圖4　三種PCR的靈敏度檢測(cè)Fig.4　The comparison of sensitivity of three methods

圖5　菌液PCR檢測(cè)Fig.5　The results of bacterial PCR

距，但是仍然可以證明巢式PCR具有高度靈敏性.其原因可能包括兩方面：首先樣本不同，本試驗(yàn)的檢測(cè)對(duì)象為側(cè)耳，李文杰的研究對(duì)象為克氏原螯蝦.其次引物設(shè)計(jì)不同，本實(shí)驗(yàn)采用兼并引物而非特異引物，而李文杰則是在特異引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的研究.鹿連明等[9]對(duì)柑橘黃龍病菌的研究發(fā)現(xiàn)：針對(duì)同一基因，引物擴(kuò)增特異性及靈敏度與擴(kuò)增條帶大小無(wú)關(guān)，但是PCR擴(kuò)增的目的基因不同，其靈敏度也會(huì)存在差異.因此實(shí)驗(yàn)中的靈敏度檢測(cè)存在差異也可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛴嘘P(guān).

試驗(yàn)中巢式PCR會(huì)存在一些極弱的非特異性條帶，可能的原因是第一輪PCR擴(kuò)增后會(huì)有殘留的第一對(duì)引物，產(chǎn)生極弱的競(jìng)爭(zhēng)性，對(duì)巢式PCR結(jié)果形成干擾.所以第一輪PCR加入的引物量同樣很重要，并且第一輪PCR產(chǎn)物的濃度控制同樣也很關(guān)鍵.

利用密碼子的兼并性設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增基因組DNA已經(jīng)得到充分的利用.但是兼并引物存在特異性過低，易導(dǎo)致錯(cuò)配，引物利用率過低的局限性.建立一個(gè)適合兼并引物的PCR方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增十分重要，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巢式PCR非常適合利用兼并引物進(jìn)行基因特異性擴(kuò)增.

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責(zé)任編輯：高山

Comparison of Gene Amplification Effect under Three Methods

of PCR Based on Degenerate Primers

LI Zhiqiang,HE De,LI Cuixin*

(College of Life Sciences,Sothwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Abstract：Three PCR methods(conventional PCR, touchdown PCR, nested PCR) were used to amplify the DNA topoisomeraseⅡ fragments of Pleurotus ostreatus and P.eryngii var ferulae with degenerate primers,which were designed with the gene sequences of DNA topoisomerase Ⅱ from NCBI. Their PCR sensitivity and specificity were compared. The result showed that the sensitivity and specificity of nested PCR were highest, and its sensitivity was 100 fold higher than conventional PCR, which indicated that the nested PCR was more suitable for PCR amplification under degenerate primers.This study will have some guidance significance to obtain the specific gene through degenerate primers.

Key words：degenerate primer; conventional PCR; touchdown PCR; nested PCR

DOI:10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.06.016

文章編號(hào)：1008-8423(2015)02-0174-05

通信作者：

作者簡(jiǎn)介：朱照武(1989- )，女，碩士生，主要從事林特食品加工與開發(fā)；*莫開菊(1965- )，女，博士，教授，主要從事食品加工及天然產(chǎn)物化學(xué)的研究.

基金項(xiàng)目：湖北省研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2010BBB016).

收稿日期：2015-05-19.

中圖分類號(hào)：S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A