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腸道微生態(tài)在功能性便秘中的研究進(jìn)展

吳宛蔚綜述張艷麗審校

東區(qū)中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科(現(xiàn)在單位)(吳宛蔚)

【關(guān)鍵詞】功能性便秘；腸道微生態(tài)；進(jìn)展

目前，隨著人民生活水平的日益提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變、生活節(jié)奏的加快、社會(huì)心理因素的改變等多重因素影響，使得便秘的患病率逐年上升[1]。便秘癥狀反復(fù)或持續(xù)，會(huì)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。慢性便秘的病因中，大部分是功能性疾病[3]，其病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全清楚，目前很多研究顯示慢性便秘患者存在腸道菌群的紊亂，菌群紊亂會(huì)誘發(fā)和加重便秘癥狀[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有望可以通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)一步揭示腸道菌群紊亂在功能性便秘發(fā)病中的作用。本文就腸道菌群在功能性便秘發(fā)病機(jī)制中的研究作一綜述。

1腸道微生態(tài)

1.1定義腸道微生態(tài)是指在腸道這個(gè)特殊微生態(tài)環(huán)境內(nèi)寄居的全部微生物，包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物，它們互相制約、互相依存，同時(shí)對(duì)宿主人體的物質(zhì)代謝、消化吸收和免疫防御都產(chǎn)生影響，最后形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)平衡，是全身生理學(xué)系統(tǒng)不可分割的組成部分[5]。一個(gè)健康人體攜帶的微生物總重量約為1 271 g, 其中腸道1 000 g, 肺20 g, 口腔20 g, 鼻10 g, 眼1 g, 陰道20 g, 皮膚200 g。人體表面和體內(nèi)定植有1 014個(gè)固有的原核細(xì)胞，是人體自身細(xì)胞數(shù)量的10倍[6]，采用Illumina Genome Analyzer技術(shù)獲得330萬(wàn)個(gè)非冗余人體腸道元基因組的參考基因, 是人類(lèi)自身總基因( 2萬(wàn)多) 的150 倍。在這些微生物中，腸道細(xì)菌在人體的病理生理方面起到非常重要的作用。既往文獻(xiàn)推測(cè)細(xì)菌種類(lèi)大約有30個(gè)屬400~ 500多種，但使用Illumina GA測(cè)序方法后，發(fā)現(xiàn)人體腸道內(nèi)的細(xì)菌有1 000~1 150種,平均每個(gè)人體內(nèi)約含有160種優(yōu)勢(shì)菌種, 超出了以往的估測(cè)[7]。

1.2菌群寄生部位及數(shù)量由于胃酸、膽汁的作用以及小腸液流量大、蠕動(dòng)快，故十二指腸、空腸、回腸細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量極少，每克內(nèi)容物中僅含101~103個(gè)細(xì)胞的細(xì)菌。回腸末端由于腸液流量少，蠕動(dòng)減慢，細(xì)菌數(shù)增加，到結(jié)腸中每克內(nèi)容物的細(xì)菌數(shù)增加至1 011~1 012個(gè)細(xì)胞，其中厭氧菌(主要是雙歧和類(lèi)桿菌)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而需氧或兼性厭氧菌總數(shù)相加不超過(guò)5%[8]。人體腸道菌群在腸腔內(nèi)形成3個(gè)生物層: 深層的緊貼黏膜表面并與黏膜上皮細(xì)胞粘連形成細(xì)菌生物膜, 該菌群稱(chēng)為膜菌群, 主要由雙歧桿菌和乳酸桿菌組成; 中層為糞桿菌、消化鏈球菌、韋榮球菌和優(yōu)桿菌等厭氧菌; 表層的細(xì)菌可游動(dòng)稱(chēng)為腔菌群, 主要是大腸埃希桿菌、腸球菌等需氧和兼性需氧菌[9]。

1.3生理意義腸道菌群在維持宿主的健康中發(fā)揮重要作用，參與宿主體內(nèi)多種生理活動(dòng)[10，11]。

1.3.1參與物質(zhì)代謝： 利用本身特有的酶類(lèi)補(bǔ)充宿主消化酶，使未消化吸收的外源性碳水化合物及內(nèi)源性糖蛋白發(fā)酵, 產(chǎn)生吸收利用的短鏈脂肪酸, 補(bǔ)充能量，也有利于宿主進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、微量元素、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等。

1.3.2調(diào)節(jié)免疫功能： 通過(guò)活化腸黏膜內(nèi)的淋巴組織，使sIgA合成增加；促進(jìn)淋巴、巨噬、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，使細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)；同時(shí)誘導(dǎo)T、B、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，增強(qiáng)特異、非特異免疫功能，從而抵御感染。

1.3.3抵御病原體侵犯： 通過(guò)占位效應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、生物奪氧作用、生物拮抗作用以及產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物SCFA(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)降低局部pH，來(lái)抑制條件致病菌生長(zhǎng)和外來(lái)菌入侵，成為宿主的生物屏障。

1.4腸道微生態(tài)與相關(guān)疾病腸道微生態(tài)改變與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如小腸細(xì)菌過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的腸易激綜合征、炎性腸病、艱難梭菌相關(guān)性腹瀉；細(xì)菌缺失引起的自身免疫病；異常的細(xì)菌代謝引起的肥胖、糖尿病、肝硬化、精神心理疾病等。目前越來(lái)越多的研究表明便秘患者腸道菌群異常，腸道菌群異常又會(huì)加重便秘，而且菌群失調(diào)作為二次性的病因又會(huì)引起其他疾病[12]。

2功能性便秘患者和腸道微生態(tài)改變

2.1功能性便秘功能性便秘表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、糞便干硬、排便不盡感和/或排便困難及需要人工輔助排便等[13]。我國(guó)成人慢性便秘患病率為4%～6%，并隨年齡增長(zhǎng)而升高，60歲以上的患病率可增加到22%[14]，其中主要是功能性便秘。以往公認(rèn)結(jié)腸高幅推進(jìn)性收縮(HAPCs)減少、結(jié)腸對(duì)刺激的收縮反射減弱、結(jié)腸感覺(jué)神經(jīng)病變、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)減少、肛門(mén)括約肌及盆底肌肉的不協(xié)調(diào)收縮等均參與便秘的病理生理機(jī)制[15~18]。近年來(lái)已有相關(guān)研究表明便秘患者的腸道微生態(tài)發(fā)生了改變。

2.2功能性便秘者腸道菌群改變基于傳統(tǒng)便培養(yǎng)方法，國(guó)外Khalif等[19]的研究表明：成人慢性便秘患者較健康人群糞便中雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、糞鏈球菌屬、梭菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量顯著下降，同時(shí)大腸埃希桿菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌科(檸檬酸桿菌、克雷伯菌等)及真菌等潛在致病菌數(shù)量顯著增加，且這一趨勢(shì)與便秘的嚴(yán)重程度相關(guān)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究老年便秘患者的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)該組患者腸道中腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、類(lèi)桿菌、梭桿菌的數(shù)量與非便秘人群相比有顯著性差異, 提示老年便秘患者存在腸道菌群紊亂[20，21]。而近年來(lái)，通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)等分子生物學(xué)方法，比較不同年齡組糞便中腸道菌群的構(gòu)成，也進(jìn)一步證實(shí)了老年人中乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌數(shù)量減少，腸細(xì)菌等兼性厭氧菌數(shù)量增加。王芳等[22]的研究發(fā)現(xiàn)重度功能性便秘患者存在腸道微生態(tài)異常，表現(xiàn)雙歧桿菌、乳酸桿菌減少，腸球菌屬增多，并且大便黏膩患者更易合并腸道真菌異常。Zoppi等[23]的研究表明，便秘兒童糞樣中菌群總體結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯異常，厭氧菌/需氧菌比例基本正常，但梭菌屬、雙歧桿菌屬較健康兒童明顯增多，梭菌屬和腸桿菌屬的一些非常規(guī)菌種被頻繁檢出。然而上述研究多采用培養(yǎng)法，其準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3腸道菌群在便秘機(jī)制中的作用腸道微生態(tài)可能參與便秘的發(fā)生和發(fā)展，但是確切的機(jī)制并不十分清楚。研究表明雙歧桿菌能酵解寡糖等產(chǎn)生醋酸和乳酸，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)，使糞便連續(xù)不斷地推向肛門(mén)，最后排出體外，不致引起便秘。當(dāng)某些因素作用于機(jī)體，破壞了腸道微生物群，雙歧桿菌等常住厭氧菌數(shù)量下降時(shí)，有許多難消化的寡糖在大腸中堆積，缺少雙歧桿菌酵解，患者就會(huì)出現(xiàn)腹脹、腹痛、便秘等癥狀[24]。Dima等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，乳糖呼氣實(shí)驗(yàn)(LBT)產(chǎn)氫量減少的便秘型IBS患者較產(chǎn)氫量正常或增加的患者發(fā)生便秘的比率明顯增高(73.33% vs. 31.58%，OR=5.95，95%CI 1.75～20.25)，提示腸道菌群改變可能參與便秘癥狀的發(fā)生。Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn)便秘型IBS患者中產(chǎn)甲烷氣的細(xì)菌主要是史氏甲烷短桿菌，糞便中這一細(xì)菌的比例同呼出的甲烷氣含量呈正相關(guān)。機(jī)制研究顯示，離體豚鼠空腸以甲烷氣體孵育后顯著地降低空腸蠕動(dòng)速度并增加收縮振幅；氫氣孵育能縮短結(jié)腸傳輸時(shí)間，但氫氣與甲烷氣等體積混合后這種作用消失。這一結(jié)果提示腸道菌群產(chǎn)生的甲烷氣可能參與腸道神經(jīng)肌肉功能的調(diào)節(jié)，但具體制有待進(jìn)一步闡明[27]。

2.4腸道菌群成為便秘治療的靶點(diǎn)

2.4.1抗生素在便秘治療中的應(yīng)用： 早在1995年Celik等[28]進(jìn)行的交叉設(shè)計(jì)臨床研究中，萬(wàn)古霉素250 mg，3次/d，連續(xù)14 d，雖然沒(méi)有改變?nèi)站疟懔亢徒Y(jié)腸傳輸時(shí)間，但可以顯著改善便秘次數(shù)、糞便性狀、減輕排便困難，提示干預(yù)腸道菌群有可能成為便秘治療的有效靶點(diǎn)。一項(xiàng)雙盲隨機(jī)對(duì)照研究顯示，新霉素500 mg，2次/d，服用10 d可以清除便秘型IBS患者腸道產(chǎn)甲烷者產(chǎn)生的甲烷，并改善這一部分患者的便秘癥狀。然而抗生素干預(yù)腸道菌群有可能導(dǎo)致耐藥性發(fā)生和新的腸道菌群失調(diào)，其利弊有待進(jìn)一步探討[29]。

2.4.2益生菌在便秘治療中的應(yīng)用： 另有多個(gè)隨機(jī)對(duì)照研究表明口服益生菌可改變結(jié)腸內(nèi)的代謝環(huán)境，改變生理活性物質(zhì)濃度，促進(jìn)結(jié)腸的動(dòng)力和分泌功能，提高便秘患者的排便頻率、改善糞便形狀[30]。一項(xiàng)納入266例患者的系統(tǒng)綜述顯示，3種益生菌株：乳酸雙歧桿菌、干酪乳桿菌和大腸埃希桿菌，可能對(duì)成人便秘患者有治療作用，需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)[31]。國(guó)外有研究表明慢性便秘患者服用益生菌4周后，大便次數(shù)及性狀明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[32]。我國(guó)2013年慢性便秘診治指南中提出益生菌的治療方案，但尚需更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。一項(xiàng)北京女性便秘患者的隨機(jī)對(duì)照研究中，試驗(yàn)組飲用含三種益生菌的牛奶2周后，出現(xiàn)排便次數(shù)增加，大便性狀及便秘評(píng)分顯著改善[33]。以上研究均說(shuō)明益生菌有效緩解便秘癥狀，但詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

另有學(xué)者使用瀉劑比沙可啶治療便秘，患者便秘癥狀緩解的同時(shí)腸道有益菌數(shù)量增多、有害菌數(shù)量減少，但治療停止后腸道菌群又恢復(fù)到治療前狀態(tài)，由此認(rèn)為腸道菌群的改變是繼發(fā)于便秘[32]。以上不同的研究引申出腸道菌群變化與便秘孰因孰果的爭(zhēng)論。實(shí)際上，機(jī)體與腸道菌群是一個(gè)互相作用的關(guān)系，腸道菌群的改變會(huì)影響機(jī)體健康，機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變也會(huì)影響腸道菌群。

3高通量測(cè)序和宏基因組學(xué)在便秘患者腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用前景

隨著技術(shù)手段進(jìn)步，研究腸道微生物的方法已經(jīng)從早期的細(xì)菌分離培養(yǎng)和基于16S基因的變性梯度凝膠電泳、生物芯片等，逐漸發(fā)展到16S高通量測(cè)序和宏基因組測(cè)序，目前已經(jīng)能夠從全基因組水平分析腸道菌群的構(gòu)成，更好的解釋腸道的功能以及病理生理現(xiàn)象[34]。

3.1高通量測(cè)序和宏基因組學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，它實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)幾百萬(wàn)DNA分子測(cè)序的可能性， 達(dá)到鑒定微生物的單一基因或全基因組的目的。高通量測(cè)序通量大, 序列讀長(zhǎng), 測(cè)序成本低, 可以高效廉價(jià)的測(cè)定所有重要生物的基因組序列, 完全契合宏基因組學(xué)研究的要求, 大大促進(jìn)了宏基因組學(xué)的發(fā)展。目前，454測(cè)序、Illumina GA測(cè)序和ABI SOLiD已經(jīng)發(fā)展為主流的高通量測(cè)序技術(shù)[35]。

宏基因組學(xué)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象, 以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段, 研究微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間關(guān)系的新微生物研究方法[7]。腸道微生物菌群較為復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，糞便樣品中99%的微生物難以檢出，因此難以反應(yīng)真正的病原菌。宏基因組學(xué)研究的是整個(gè)微生物群落，無(wú)需分離單個(gè)細(xì)菌，可以檢測(cè)出那些不能被分離培養(yǎng)的微生物，可以揭示更高更復(fù)雜層次上的生命運(yùn)動(dòng)規(guī)律。

2008年，歐盟啟動(dòng)迄今最大的腸道細(xì)菌基因研究——“人類(lèi)腸道宏基因組計(jì)劃”(MetaHIT)，旨在對(duì)人類(lèi)腸道細(xì)菌進(jìn)行“基因普查”。腸道菌群全基因組的研究結(jié)果令人鼓舞[7]。2010年，MetaHIT公布第一個(gè)人類(lèi)腸道菌群宏基因組目錄建立，該項(xiàng)研究產(chǎn)生了近6千億腸道菌群堿基序列，獲得了330萬(wàn)個(gè)非冗余的宏基因組參考基因(約是人類(lèi)自身基因的150倍)，被視為人類(lèi)第二基因組。既往文獻(xiàn)推測(cè)腸道細(xì)菌種類(lèi)大約30個(gè)屬400~ 500多種，但經(jīng)過(guò)宏基因組學(xué)研究后，推測(cè)人體腸道存在1 000~1 150種細(xì)菌，平均每個(gè)個(gè)體含160種優(yōu)勢(shì)菌種，并且這些細(xì)菌為絕大部分個(gè)體所共有。另一項(xiàng)研究是2011年Arumugam等[36]利用Sanger測(cè)序?qū)W洲4國(guó)22名個(gè)體糞便樣本DNA進(jìn)行聚類(lèi)分析及主成分分析，根據(jù)腸道細(xì)菌種類(lèi)的豐度進(jìn)行分型：1型為擬桿菌屬，2型為普雷沃氏菌屬，3型為瘤胃球菌屬。如同血型一樣，這些腸菌類(lèi)型與性別、年齡、種族和BMI都無(wú)關(guān)。這些概念的提出大大推動(dòng)了腸道菌群多樣性與疾病相關(guān)性的研究。

3.2高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因組學(xué)方法在慢性便秘研究中的前景目前，高通量測(cè)序和宏基因組學(xué)方法尚未在慢性便秘機(jī)制研究中廣泛應(yīng)用。De Filippo等[37]采用454測(cè)序技術(shù)比較健康歐洲孩子(EU)及健康非洲農(nóng)村孩子(BF)腸道微生物群落組成，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有意義，而且含有纖維素和木聚糖水解基因的菌株只存在于BF中。Bailey等[38]也利用454測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)壓力狀態(tài)會(huì)改變小鼠腸道微生物豐富度，長(zhǎng)期處在壓力下的小鼠腸道厭氧菌增多。國(guó)外有學(xué)者采用16S rRNA的高通量測(cè)序方法研究腸易激綜合征時(shí)發(fā)現(xiàn)，該組患者的腸道黏膜和糞便的細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)均發(fā)生了變化，并且在宿主和細(xì)菌之間存在相互作用的關(guān)系。一種假說(shuō)認(rèn)為腸道菌群異常激活腸黏膜免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致黏膜通透性改變、內(nèi)臟疼痛感覺(jué)神經(jīng)通路被激活和腸神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[39]。

4展望

可見(jiàn)腸道微生態(tài)與功能性便秘有著非常密切的關(guān)系，腸道微生態(tài)改變參與便秘的病理生理機(jī)制，同時(shí)也可能成為便秘治療的靶點(diǎn)。將來(lái)的研究方向就是應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)，從宏基因組水平研究便秘患者腸道菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分析其基因組的特征性片段，建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，明確腸道菌群在便秘發(fā)病中的機(jī)制，同時(shí)也可以為功能性便秘的腸道微生態(tài)治療提供理論依據(jù)。

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綜述

收稿日期：(2015-07-15)

【DOI】10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.12.033

通信作者：張艷麗，E-mail:janetzyl@aliyun.com

作者單位： 100029北京中日友好醫(yī)院消化內(nèi)科(吳宛蔚、張艷麗)； 101100北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院