文│段俊秀（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心）

雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)

文│段俊秀（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心）

雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱。常引起家禽胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、關(guān)節(jié)炎、腸炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎等一系列疾病，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害巨大。本病的感染途徑很多，主要通過消化道和呼吸道感染，也可通過種蛋垂直傳播等。該病可原發(fā)，也可繼發(fā)或并發(fā)，各類年齡和品種的雞都能感染本病，是養(yǎng)雞業(yè)中最常見、危害最嚴(yán)重的疾病之一。一年四季均有發(fā)生，沒有明確的季節(jié)性，但冬季和春季多發(fā)，該病癥狀一般均呈典型經(jīng)過。雞只精神委頓、羽毛蓬亂、呼吸困難和食欲廢絕。黃、白、綠稀便交替出現(xiàn)。急性型往往發(fā)病后一周內(nèi)即死亡，亞急性或慢性型多發(fā)于成年蛋雞，患病的雞精神不振，食欲減少，飲水量增加，逐漸消瘦和下痢，但死亡率不高。

近年來，隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，該病已成為困擾養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。目前我國(guó)已分離到的雞致病性大腸桿菌血清型多達(dá)50多個(gè)，各地分離的菌株血清型不盡相同，雞源大腸桿菌（E.coli）常見的致病性血清型是01、02、035和078，但在同發(fā)病地區(qū)或雞場(chǎng)也有其他血清型為優(yōu)勢(shì)致病性血清型。

該病的防治主要使用抗菌藥、抗生素，藥物的大量和頻繁使用，導(dǎo)致耐藥性微生物的出現(xiàn)，這不僅給畜禽疫病的治療帶來困難，而且會(huì)將致病性耐藥菌傳遞給人類，甚至能將內(nèi)源耐藥菌群的耐藥基因擴(kuò)散到環(huán)境和傳遞給人類致病菌，使抗菌藥對(duì)人類疾病的治療效果下降或消失，這是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。但是基層缺乏實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)的條件，在生產(chǎn)上盲目濫用藥物，造成大腸桿菌耐藥菌株不斷產(chǎn)生，致使該病治療效果下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留給養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的身體健康帶來潛在危害。因此，分離鑒定雞大腸桿菌血清型及耐藥性現(xiàn)狀，以期為臨床防治本病提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料。

（1）病料來源。樣品來自太谷縣周邊幾個(gè)雞養(yǎng)殖場(chǎng)，共采樣25份，經(jīng)臨床診斷為雞大腸桿菌病，用滅菌棉拭子插入患腹瀉病雞的糞便或臟器中，旋轉(zhuǎn)后取出，接種到裝有無菌生理鹽水的5毫升離心管中，4℃保存，以備檢驗(yàn)。

（2）培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、普通肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管；甲基紅（M.R）試劑、乙酰甲基甲醇（V-P）試劑、靛基質(zhì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基等均按照常規(guī)方法配制。細(xì)菌生化微量鑒定管。

（3）大腸桿菌O抗原定型血清診斷液。大腸桿菌O抗原定型血清診斷液購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

（4）試驗(yàn)動(dòng)物。體重20～25克小白鼠20只，健康活潑，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心。

（5）試驗(yàn)藥品。選擇硫酸阿米卡星、鹽酸左旋氧氟沙星、氟苯尼考、新霉素、頭孢曲松鈉、頭孢噻噁鈉、卡那霉素、頭孢噻呋鈉、慶大霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、先鋒Ⅴ號(hào)等藥物進(jìn)行。

2.試驗(yàn)方法。

（1）細(xì)菌分離培養(yǎng)。所采集病料取0.5g，加適量稀釋液研磨，10倍稀釋后過濾、離心，取上清液在無菌工作臺(tái)中將樣品用接種環(huán)接種于普通培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18小時(shí)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況、菌落特征。然后挑取單個(gè)菌落接種于麥康凱瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后挑取可疑、紅色、中等大小、光滑菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。革蘭染色情況、形態(tài)、大小等均符合大腸桿菌特征的菌株初步確定為大腸桿菌。對(duì)疑似大腸桿菌進(jìn)行菌種保存。

（2）生化試驗(yàn)。將分離純化的細(xì)菌在無菌條件下進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、二乙酰（V-P）試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)檢測(cè)。

（3）致病性試驗(yàn)。20只小白鼠分成2組，每組10只。Ⅰ組為試驗(yàn)組，用雞大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物接種，腹腔注射0.3毫升/只；Ⅱ組為對(duì)照組，腹腔注射滅菌生理鹽水0.3毫升/只。注射后每天觀察2次，連續(xù)觀察7天。剖檢病、死鼠，取死鼠的肝臟進(jìn)行涂片染色鏡檢，再將其接種于麥康凱瓊脂，挑取可疑菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)，進(jìn)行觀察。

（4）血清型鑒定。按大腸桿菌O抗原定型血清診斷液使用說明書操作。首先將分離的細(xì)菌進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，初步篩選疑似O血清型菌株，然后通過試管凝集反應(yīng)進(jìn)一步確定其血清型。

（5）耐藥性試驗(yàn)。采用紙片法，從細(xì)菌純培養(yǎng)物上，選擇形態(tài)完整的菌落接種于5毫升肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6～8小時(shí)后，肉湯呈混濁狀。振蕩搖勻，用滅菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，分別記錄、編號(hào)。將鑷子于酒精燈火焰上略停滅菌，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面，在平皿中央貼一片，外周可等距離貼6片。置于37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于20毫米為高度敏感；抑菌圈直徑在10～20毫米之間為中度敏感；抑菌圈直徑小于10毫米為耐藥。

二、結(jié)果與分析

1.細(xì)菌的分離培養(yǎng)。從25份病料中，分離出大腸桿菌11株，分離率為44%。分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)24小時(shí)后，形成圓形、邊緣整齊、隆起、光滑、濕潤(rùn)、灰白色的菌落，直徑為2～3毫米；在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的小菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落；在普通肉湯中呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀，振蕩呈云霧狀散開。革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性、無芽孢、短小、兩端鈍圓的短桿菌。

2.生化試驗(yàn)。11株分離菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣；M.R、吲哚試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性；對(duì)枸櫞酸鹽、明膠、V-P反應(yīng)陰性；符合大腸桿菌生化特性。

3.致病性試驗(yàn)。Ⅰ組2只小鼠5小時(shí)內(nèi)死亡，5只24小時(shí)內(nèi)死亡，3只36小時(shí)內(nèi)死亡。病理剖檢可見肝臟腫大，有壞死灶及出血點(diǎn)；腸嚴(yán)重鼓氣，心包瘀血，肺出血，脾臟瘀血。采取死亡小鼠肝和脾接種在麥康凱瓊脂平板及普通肉湯，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，有細(xì)菌生長(zhǎng)。革蘭氏染色及生化鑒定表明此菌與接種細(xì)菌為同種細(xì)菌。說明該菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病力。Ⅱ組飼養(yǎng)7天后全部存活，剖檢未見明顯病變。

4.血清型鑒定。11株大腸桿菌主要血清型是O157。

5.藥敏試驗(yàn)結(jié)果。18株大腸桿菌對(duì)14種抗生素有不同程度的耐藥。具體結(jié)果見表1。

表1 大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

三、結(jié)論與討論

1.分離株鑒定及發(fā)生感染的原因。經(jīng)過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性的鑒定，可以得知引發(fā)該地區(qū)肉雞發(fā)病死亡的致病菌為致病性大腸桿菌，且其血清型為O157。大腸桿菌為條件性致病菌，而現(xiàn)在肉雞飼養(yǎng)主要采用網(wǎng)上平養(yǎng)的方式，飼養(yǎng)密度大，雞舍空氣污濁，通風(fēng)不良，光線照射不足，肉雞生長(zhǎng)速度快，耗氧量大以及環(huán)境衛(wèi)生與飼養(yǎng)管理不善等因素常可導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，腸道正常菌群的微生態(tài)平衡被破壞，致使細(xì)菌大量繁殖而發(fā)病。因此，平時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好雞舍及周圍環(huán)境的衛(wèi)生；發(fā)病時(shí)，應(yīng)及時(shí)采取隔離措施，并對(duì)雞舍及污染場(chǎng)地進(jìn)行清理消毒。

2.耐藥菌株產(chǎn)生的原因。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見，太谷縣雞場(chǎng)的大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、先鋒Ⅴ號(hào)等有耐藥性，對(duì)鹽酸左旋氧氟沙星、頭孢曲松鈉、頭孢噻噁鈉、頭孢噻呋鈉、卡那霉素、慶大霉素等中度敏感，對(duì)氟苯尼考、新霉素、硫酸阿米卡星高度敏感。結(jié)果表明前幾次治療使用的敏感藥物這次藥敏試驗(yàn)結(jié)果就不理想，主要原因是臨床上長(zhǎng)期大量和不規(guī)范的使用抗菌藥物，致使大腸桿菌耐藥菌株不斷產(chǎn)生，耐藥譜也越來越廣泛。

很多養(yǎng)殖戶為了達(dá)到治療的效果，盲目加大用藥劑量，不僅破壞雞腸道的正常菌群，而且間接影響人體健康，最后會(huì)導(dǎo)致藥物殘留。因此，在選擇抗菌藥物上最好考慮采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免因細(xì)菌長(zhǎng)期與某一種藥物接觸而增強(qiáng)耐藥性。

大腸桿菌耐藥性的出現(xiàn)可能與菌株長(zhǎng)期處于多種抗生素選擇的環(huán)境中，其耐藥基因通過染色體或耐藥質(zhì)粒在菌群間廣泛傳播或擴(kuò)散有關(guān)。加強(qiáng)生物安全措施，合理使用疫苗，選擇有效的抗生素，才是控制大腸桿菌最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

如果使用疫苗，由于地區(qū)不同，細(xì)菌血清型有差異，建議有條件的肉雞場(chǎng)可以采用自家苗免疫，這樣效果可能會(huì)可靠。但是如果發(fā)病雞出現(xiàn)纖維素性肝周炎和心包炎時(shí)，治療效果就不理想，總之，雞大腸桿菌病流行病學(xué)具有極其復(fù)雜的特征，這也是雞大腸桿菌病難以根除的關(guān)鍵所在。只有定期對(duì)本地區(qū)雞場(chǎng)的大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，配以藥敏試驗(yàn)用藥，同時(shí)加強(qiáng)管理等綜合措施，才能收到良好的防控效果。