許林平，張瑞芳，王 鵬，張建營

1)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院;河南省腫瘤醫(yī)院科研外事辦 鄭州450008 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)室管理辦公室 新鄉(xiāng)453003 3)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室;河南省腫瘤流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450001

眾多研究［1-2］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中存在各種類型的抗細(xì)胞自身抗原的抗體，其中與腫瘤發(fā)生有關(guān)的抗原被稱為腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)。對血清TAA 的檢測可以用于腫瘤的早期診斷，但單一抗原在腫瘤患者中出現(xiàn)的頻率較低，一般在10%～20%，所以僅采用一項(xiàng)TAA 診斷腫瘤價(jià)值十分有限，而通過聯(lián)合、使用一組“精心篩選”的TAA組合就可克服該缺點(diǎn)［3-4］。不同腫瘤可能需要不同的TAA組合，因此多種TAA 聯(lián)合檢測用于腫瘤早期診斷具有可行性和實(shí)用性。該研究對不同類型腫瘤患者進(jìn)行了8種TAA(Koc、p62、IMP1、cyclinE、p16、survivin、c-myc、p53)檢測，并評價(jià)檢測結(jié)果，探討TAA組合檢測在腫瘤診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 血清標(biāo)本 304 份不同類型腫瘤患者(98例肺癌、69例食管癌、50例肝癌、46例結(jié)直腸癌、41例乳癌)和58 份正常人血清標(biāo)本由大連市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。腫瘤患者血清均采集于首次到大連市中心醫(yī)院就診、經(jīng)組織病理學(xué)確診并且沒有接受過任何化療或放療的患者。正常對照血清采集于到該院正常體檢、經(jīng)查無任何腫瘤相關(guān)疾病的健康成年人。

1．2 主要試劑和儀器 8種TAA(Koc、p62、IMP1、cyclinE、p16、survivin、c-myc、p53)由美國德克薩斯州大學(xué)生命科學(xué)系腫瘤免疫與腫瘤分子流行病學(xué)研究室提供;HRP 標(biāo)記的羊抗人IgG 購自美國Stratagene 公司;四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫尿素、明膠購自美國Sigma 公司;96 孔酶標(biāo)板購自美國Gibco 公司;SUNRISE 自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Tecan公司。

1．3 血清中8種TAA 抗體的檢測及TAA 免疫活性驗(yàn)證 采用ELISA 法［5］測定血清中8種TAA 抗體。8種TAA 分別用包被稀釋液稀釋成0．5 mg/L，包被96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，用30 g/L 明膠封閉2 h;加入一抗待測血清(1∶100 稀釋)，以PBS 作為空白對照，每孔100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3次;加入HRP 標(biāo)記的羊抗人IgG 二抗(1∶4 000 稀釋)，每孔100 μL，37℃孵育1 h，洗板3次;加入TMB-過氧化氫尿素顯色液，每孔100 μL，37℃濕盒加熱避光反應(yīng)至充分顯色，加終止液50 μL;在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取450 nm 處的OD 值。選擇4個(gè)正常對照和2個(gè)腫瘤患者血清標(biāo)本用于批間可靠性的判斷。結(jié)果判定:每份樣品血清做2 孔，取平均值為最后結(jié)果。設(shè)空白孔調(diào)零。以58例正常人血清OD值的平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為判斷臨界值，高于此值為陽性，低于此值為陰性。將ELISA 陽性反應(yīng)的血清標(biāo)本進(jìn)一步用Western blot 技術(shù)驗(yàn)證其對TAA 的免疫活性［6］，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法對不同組間TAA 陽性率進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 單一TAA 檢測結(jié)果 見表1。腫瘤患者血清中8種TAA 陽性率普遍偏低，最高為肝癌中的cyclinE，陽性率達(dá)34．0%;但均高于正常人。

表1 8種TAA 抗體檢測結(jié)果 陽性數(shù)(%)

2．2 不同TAA組合檢測結(jié)果 以單一TAA 抗體陽性率最高的TAA 為組合檢測的起點(diǎn)，以每增加一種TAA 要保證能最大程度地提高檢測靈敏度為原則，對不同TAA組合檢測進(jìn)行了分析，見表2。從表2 可以看出，隨TAA組合數(shù)目的增加直至最終的8種抗原聯(lián)合，無論哪種腫瘤，陽性率均逐步增加。

2．3 不同TAA組合檢測的診斷價(jià)值 不同TAA組合診斷價(jià)值見表3、表4。結(jié)果顯示，隨著TAA組合種類的增加直至最終的8種TAA組合，對腫瘤的合計(jì)診斷靈敏度(Se)從11．5%逐步提高至63．5%，特異度(Sp)從100．0%降至86．2%。不同類型腫瘤診斷的約登指數(shù)從一種TAA 的0．049～0．180提高到8種TAA組合的0．423～0．522。預(yù)測值也隨TAA組合的變化而變化，如8種TAA組合時(shí)，不同類型腫瘤診斷的陽性預(yù)測值(PPV)為74．2%～88．7%，陰性預(yù)測值(NPV)則為58．8%～75．8%。

表2 不同TAA組合檢測結(jié)果 陽性數(shù)(%)

表3 不同TAA組合診斷價(jià)值的評價(jià)

表4 8種TAA組合的診斷價(jià)值

3 討論

腫瘤發(fā)生的多因素、多步驟分子機(jī)制為生物標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷提供了理論支持，但眾多研究表明，沒有任何單一標(biāo)志物可以完全識別和區(qū)分腫瘤患者和正常人，因此，多個(gè)標(biāo)志物的組合就可能成為腫瘤早期診斷的一種有效方法。腫瘤患者血清中存在有多種抗TAA 的自身抗體，可作為腫瘤發(fā)生過程中識別異?；蚴д{(diào)細(xì)胞機(jī)制的早期標(biāo)志［7］。近十余年來，TAA 作為監(jiān)測腫瘤發(fā)生的早期生物學(xué)標(biāo)志已經(jīng)得到廣泛和深入的研究，尤其多種TAA 的組合在腫瘤診斷中的價(jià)值更大［8-10］。

該研究對304 份不同類型腫瘤患者血清中的8種TAA 進(jìn)行了檢測及診斷效能分析，結(jié)果顯示，單一TAA 對腫瘤的診斷靈敏度普遍較低，從4．9%～18．0%，8種TAA組合對腫瘤的診斷靈敏度升高至56．1%～66．0%;8種TAA組合診斷的陽性似然比達(dá)4．60，陰性似然比為0．42，PPV 達(dá)96．0%，NPV 達(dá)31．1%，說明8種TAA組合檢測腫瘤的臨床診斷價(jià)值較高。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了“精心挑選的多種TAA組合能夠大大提高腫瘤診斷的靈敏度”這一觀點(diǎn)。

目前有關(guān)TAA組合在臨床上的實(shí)用性研究仍處于起步階段，在TAA組合廣泛應(yīng)用于診斷腫瘤、監(jiān)測腫瘤進(jìn)展、指導(dǎo)腫瘤治療等方面之前，定義TAA 系統(tǒng)的最優(yōu)組合、最大限度地提高組合的靈敏度和特異度至關(guān)重要。另外，不同腫瘤可能需要不同的TAA組合，以達(dá)到早期腫瘤免疫診斷所需要的敏感度和特異度，從而使多種TAA組合檢測并用于腫瘤早期診斷具有可行性和實(shí)用性。上述問題均需進(jìn)一步研究探討。

［1］Tan EM．Autoantibodies，autoimmune disease，and the birth of immune diagnostics［J］．J Clin Invest，2012，122(11):3835

［2］Zhang JY，Tan EM．Autoantibodies to tumor-associated antigens as diagnostic biomarkers in hepatocellular carcinoma and other solid tumors［J］．Expert Rev Mol Diagn，2010，10(3):321

［3］Paradis V，Bedossa P．In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma［J］．J Hepatol，2007，46(1):9

［4］Liu W，Peng B，Lu Y，et al．Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis［J］．Autoimmun Rev，2011，10(6):331

［5］陳俊林，王鵬，閆平平，等．肺癌早期診斷12種腫瘤相關(guān)抗原微陣列檢測分析［J］．中國公共衛(wèi)生，2012，28(4):479

［6］Ye H，Sun C，Ren P，et al．Mini-array of multiple tumor-associated antigens (TAAs)in the immunodiagnosis of breast cancer［J］．Oncol Lett，2013，5(2):663

［7］Tan EM，Zhang J．Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system［J］．Immunol Rev，2008，222:328

［8］Liu W，Wang P，Li Z，et al．Evaluation of tumour-associated antigen(TAA)miniarray in immunodiagnosis of colon cancer［J］．Scand J Immunol，2009，69(1):57

［9］劉會(huì)娟，王鵬，閆平平，等．腫瘤相關(guān)抗原的抗體檢測在原發(fā)性肝癌早期診斷中的價(jià)值［J］．中國腫瘤臨床，2008，35(19):1112

［10］徐莉娟，代麗萍，王凱娟，等．多種腫瘤相關(guān)抗原抗體在乳癌早期診斷中的應(yīng)用［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，47(2):241