陳 軍，左華江，李和平，李思學，楊福全

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541004；2.廣西科技大學化學與生物工程學院，廣西柳州 545006）

隨著消費者對健康衛(wèi)生衣著的需求與日俱增，織物的抗菌應用成為織物市場發(fā)展最快的方向之一，如何進行織物的抗菌改性從而殺滅或抑制有害微生物在織物上生長的研究也日漸增加。蠶絲作為高級紡織材料，穿著柔軟舒適，兼有養(yǎng)生健體功能，但其結構多孔疏松，在加工成織品的過程中，纖維經(jīng)多重疊加后會形成無數(shù)空隙的多層體，易吸附菌類，且其天然蛋白質組成還利于有害微生物滋生繁殖。為了使生絲具備衛(wèi)生自潔功能，抑制有害微生物在其表面滋生繁殖，本研究考慮使用偶聯(lián)接枝法在脫膠生絲表面接入季胺鹽類抗菌聚合物PTDM。季胺鹽類抗菌聚合物被廣泛認為具有良好且持久的抗菌性能，穿透微生物細胞膜能力強，穩(wěn)定性好，對皮膚刺激小，殘余毒性低等優(yōu)點。抗菌聚合物PTDM由馬來酸酐、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯通過自由基聚合物法合成而得，其中馬來酸酐與脫膠生絲表面含氧官能團反應，將三元共聚物PTDM牢固接枝在脫膠生絲表面，制備出具有高效安全的抗菌生絲。該抗菌生絲對大腸桿菌有良好的抑菌殺菌能力，是高效低毒、對環(huán)境友好的抗菌材料。

1 實驗藥品及儀器

表1示出了實驗藥品及生產(chǎn)廠家。

表1 實驗藥品及生產(chǎn)廠家

本實驗所用水均為去離子水。

DMAEMA和TBAEMA由于其結構的特殊性易發(fā)生均聚，在存貯過程中添加了阻聚劑，實驗時通過減壓蒸餾的方法加以提純。在減壓蒸餾時需加入CaH2，馬來酸酐提純時加入AIBN。既可除去體系中的H2O，還可防止單體在提純過程中自聚，并防止爆沸。收集餾分后密封冷藏保存待用。其他試劑均可直接使用。

表2示出了實驗儀器及生產(chǎn)廠家。

表2 實驗儀器及生產(chǎn)廠家

2 實驗機理

從分子結構上看，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）和甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯（TBAEMA）都是重要的丙烯酸酯單體，二者都含有高活性的叔氨基/仲氨基，酯基和聚合性的乙烯基等可反應性官能團，而順丁烯二酸酐（即馬來酸酐MAH）除了具備聚合性的雙鍵外，還獨有高活性的酸酐結構，本實驗嘗試將這3種單體進行共聚，制備目標產(chǎn)品抗菌聚合物PTDM。

引發(fā)劑能使3個單體甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯（DMAEMA）、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯(TBAEMA)與馬來酸酐（MAH）產(chǎn)生自由基，單體之間再發(fā)生共聚反應。下面反應式中，引發(fā)劑為2,2-偶氮二異丁腈（AIBN）。引發(fā)原理如下：

M1表示甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，M2表示甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯，M3表示馬來酸酐，M1、M2、M3分子式分別為：

M1·表示M1被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

M2·表示M2被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

M3·表示M3被AIBN引發(fā)后產(chǎn)生的自由基。

其他反應過長過于復雜，在此不展開討論。

3 實驗過程

3.1 抗菌聚合物PTDM的合成

將雙頸圓底燒瓶接上導氣管和冷凝管后，分別加入三單體、有機溶劑（乙醇、丙酮等）和引發(fā)劑2，2-偶氮二異丁腈（AIBN），單體總濃度取0.5 mol/L，三單體DMAEMA∶TBAEMA∶MAH的摩爾比為3∶3∶2，引發(fā)劑AIBN和單體的摩爾比為0.3∶100。攪拌均勻后，通入保護氣氮氣30min排除體系中的氧氣，升溫至65℃，在N2氣流中回流反應20h。冷卻至室溫后，旋轉蒸發(fā)除去部分多余溶劑，將反應液緩緩倒入含少量阻聚劑的蒸餾水中，靜置沉淀，過濾洗滌，先在60℃普通烘箱中初步干燥24 h，再在60℃真空烘箱中干燥24h，即得抗菌聚合物PTDM，稱重，得透明略顯黃色固體23.0755g。計算PTDM產(chǎn)率，將其放入干燥器中保存。

3.2 生絲脫膠

脫膠：取適量桑蠶絲與0.05 g/L的碳酸鈉溶液混合煮沸，精煉0.5 h，再用去離子水洗滌2次，以除去殘留離子及生絲表面脫去的絲膠蛋白，得到脫膠蠶絲。重復3次脫膠操作，生絲表面的絲膠蛋白基本除盡，只剩絲素。

3.3 生絲接枝

取適量聚合物PTDM放入20mL西林瓶中，倒入20mL有機溶劑將其完全溶解，再加入1g脫膠生絲纖維，浸泡20min后將西林瓶封口,恒溫加熱一段時間。取出生絲纖維，用丙酮浸泡洗滌3次，保持80～90℃烘干3min，再置于160～170℃下反應3 min。經(jīng)過丙酮漂洗，二浸二軋（快速浸漬，快速擠軋）后，在70℃恒溫烘干5h。計算接枝率。

式中：W0為原高聚物質量；W1為織物抗菌整理后的質量。

3.4 實驗菌株、菌懸液、培養(yǎng)基的準備

使用大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）作為實驗菌株。大腸桿菌無芽孢，常作為革蘭氏陰性短桿菌的代表性菌種用于各類實驗。

營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：用適量營養(yǎng)肉湯粉末和去離子水配成濃度為18 g/L的營養(yǎng)肉湯。在120℃滅菌20min后，存放在4℃的冰箱中備用。

TTC營養(yǎng)瓊脂：將已滅菌的營養(yǎng)瓊脂溶化，冷卻至60℃后，在無菌條件下將5%的TTC溶液加至營養(yǎng)瓊脂中，使培養(yǎng)基中TTC濃度為0.05%，即得TTC營養(yǎng)瓊脂。TTC瓊脂上的菌落計數(shù)按GB4789.28/94中7.2規(guī)定，TTC瓊脂組的菌落以呈紅色或淡紅色的點狀、圓狀或不規(guī)則形狀的顆?；驘o色但具有菌落特征的菌落為計數(shù)對象。

大腸桿菌菌株復蘇活化后，挑一環(huán)菌體接種至已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，置于轉速為150 rpm、溫度為37℃的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)18～20h，此時大腸桿菌濃度約為109CFU(colony formingunits)/mL。將菌懸液置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4 共聚物PTDM的紅外譜圖分析

我們用紅外光譜儀表征了單體和共聚物的結構，結果分別列于圖1 和圖2。這些譜圖中均檢測到DMAEMA和TBAEMA的特征吸收峰，如圖1有DMAEMA中—N(CH3)的—C—H伸縮振動峰（2 825cm-1）和TBAEMA中—C(CH3)3骨架的振動峰（1 230 cm-1）；而圖2中也有DMAEMA的—C—H伸縮振動峰（2 775 cm-1）和TBAEMA中—C(CH3)3骨架的振動峰（1 210 cm-1）。這些結果充分證明，DMAEMA和TBAEMA已成功共聚。

另外，由圖2可知，聚合后，—C——O的伸縮振動峰由1 721 cm-1向高波數(shù)方向移動到1 736 cm-1，而—C—O—的對稱及非對稱伸縮振動峰則分別由1 300和1 166 cm-1向低波數(shù)方向移動到1 274和1 237 cm-1，這正與反應相符。當—C——C—聚合后，—C——C—與—C——O—的共軛效應消失，使得—C——O—處的電子云密度增大，吸收峰隨之向高波數(shù)方向偏移；而—C—O—的電子云密度減小，吸收峰向低波數(shù)方向偏移。

圖1 單體D MAEMA 和TBAEMA 紅外光譜圖

圖2 共聚物PT D M 的紅外光譜圖

5 抗菌性能表征

5.1 表征方法

取0.5 g需測定的樣品與9mL濃度為4.6×106CFU/mL的菌懸液混合浸泡，在37℃、150 rmp下振蕩培養(yǎng)1 h、3 h，分別檢測1 h、3 h后菌落的生長情況，采用活菌計數(shù)法測定菌濃度，與初始菌濃度對比，計算抑菌率。

代入下述公式進行計算：

殺菌率η=（N0-N）/N0×100%

資源是圖書館提供信息服務的基石。在新媒體環(huán)境下，為了高質量地開展信息服務，滿足讀者多元化的信息需求，高校圖書館應在進行讀者調(diào)研的基礎上制定內(nèi)容豐富、結構合理、載體形式多樣的館藏資源建設方案，實現(xiàn)館藏結構、不同載體文獻的和諧統(tǒng)一。而民族高校圖書館也擔負著文化傳承的使命，因此在資源建設方面除了常規(guī)資源建設意外，還應根據(jù)學校學科建設需求和民族特色文化，重點加強一批具有民族性、地域性的綜合性特色數(shù)據(jù)庫的建設，以便更好地服務于民族高校師生讀者的科研需求。并在資源構建的基礎上重點打造知識服務產(chǎn)品，基于資源進行知識內(nèi)容的整合和有效的關聯(lián)，以實現(xiàn)多層次、多方位、多形式的資源傳播和信息服務。

其中：η 為殺菌率（%）；N為抗菌處理后的菌濃度（CFU/mL）；N0為初始菌濃度（CFU/mL）。

5.2 聚合物PTDM抗菌能力的表征

取合成產(chǎn)率分別為76%、48%、45%和50%的聚合物PTDM（編號為①～④），研究聚合物PTDM不同濃度時對大腸桿菌的抑菌能力差異，如表3和表4所示。

表3 產(chǎn)品①～④的抗菌測試數(shù)據(jù)對比

表4 產(chǎn)品①～④的抗菌測試圖片對比

前3個產(chǎn)品①②③的濃度取0.01 g/mL和0.001 g/mL時，對應培養(yǎng)皿上肉眼觀察不到菌落，抗菌率可達100%；第4個產(chǎn)品④的濃度取0.01 g/mL時，肉眼也觀察不到菌落，和前3個產(chǎn)品取同濃度時的抗菌率相同，但當濃度稀釋到0.001 g/mL時肉眼可見70個菌落，說明④的抗菌性低于①②③。

4個產(chǎn)品和空白試驗進行對照，呈現(xiàn)出抗菌性能隨濃度下降而減弱的趨勢。

4個產(chǎn)品的濃度范圍在0.01～0.001 g/mL時，對大腸桿菌顯現(xiàn)出良好的殺菌性，甚至可高達100%的殺菌率。當濃度更低時（0.0001 g/mL），PTDM仍具有一定殺菌能力，體現(xiàn)出其低濃度殺菌性強的優(yōu)越性。

5.3 接枝生絲抗菌能力的表征

5.3.1 不同接枝率的抗菌生絲1 h、3 h抗菌能力的差異

抽取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%和1.4%的抗菌生絲與按上述操作準備的大腸桿菌懸液浸泡（分別編號為①～⑤），經(jīng)過1 h后將反應液稀釋若干梯度，稀釋梯度為10倍，用涂布棒均勻涂抹于按上述操作準備的營養(yǎng)瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過夜，觀察菌落生長情況，如圖3。

圖3 ①～⑤號樣品反應1 h 稀釋培養(yǎng)過夜后菌落生長情況

菌落數(shù)量可直接反映對應接枝率的樣品抗菌情況，肉眼所見菌落越多，表明抗菌效果越差，反之亦然。圖3表明，①號、②號的平板菌落數(shù)較少，③號、④號次之，⑤號平板上長滿菌落。初步判定①號和②號殺菌能力較強。

依然選取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%和1.4%的抗菌生絲與按上述操作準備的大腸桿菌懸液浸泡（分別編號為①～⑤），經(jīng)過3 h后將反應液稀釋若干梯度，用涂布棒均勻涂抹于按上述操作準備的營養(yǎng)瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過夜，觀察菌落生長情況，如圖4。

圖4 ①～⑤號樣品反應3 h 稀釋培養(yǎng)過夜后菌落生長情況

從菌落數(shù)目來看，①、④號的平板菌落數(shù)最少，②、③號平板菌落數(shù)較少，⑤號的菌落數(shù)最多。表明：①、④號抑菌效果最強，⑤號抑菌效果最差。

比較圖3和圖4，發(fā)現(xiàn)④號樣品浸泡3 h時比浸泡1 h時的抗菌表現(xiàn)有很大變化，前者菌落數(shù)遠小于后者菌落數(shù)，表明浸泡時間增加后，滅菌能力得到更好發(fā)揮，抗菌能力增強，①號與④號表現(xiàn)相似，平板菌落數(shù)也隨時間增加而減少。②、③號1 h和3 h的平板菌落數(shù)基本不變，表明浸泡時間增加并沒有直接導致抗菌能力變化，生絲的抗菌效果有待觀察。⑤號1 h和3 h的平板菌落數(shù)均非常多，無法肉眼計數(shù)。以①號與④號樣品為代表，1 h和3 h的菌落數(shù)變化表明：接枝了聚合物PTDM的生絲接枝率與殺菌率有直接關系，當接枝率增大時，對大腸桿菌的殺菌率也隨之上升。原因在于接枝率上升時，生絲上具有滅菌能力的N+密度也對應增大，抗菌基團與大腸桿菌接觸幾率增大，與菌體結合能力越強，季銨基團更易穿透細胞，對大腸桿菌的殺菌能力越強，殺菌率越高。

5.3.2 不同接枝率的抗菌生絲抑菌率的差異

使用移液槍吸取已配制好的大腸桿菌懸液1 mL與已滅菌的9mL蛋白胨混合，梯度稀釋菌懸液，稀釋倍數(shù)為10，選取適當濃度菌懸液0.1mL稀釋液均勻涂布在無菌瓊脂平板上，將無菌瓊脂平板置于37℃的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)過夜，代入相應公式：

每毫升原菌液中活菌濃度/（cfu·mL-1）=同一稀釋度菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

計算得：

每毫升原菌液活菌數(shù)=45.5×104×10=4550000

仍取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%、1.4%和未接枝（接枝率為0%）的抗菌生絲與配制好的大腸桿菌懸液混合浸泡，編號為①～⑥號，置于恒溫氣浴振蕩器中反應20 h，稀釋若干倍數(shù)后，用移液槍吸取0.1mL反應液涂在已滅菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待長出菌落后，計數(shù)及計算抗菌率，得到表4數(shù)據(jù)。

表4 不同接枝率的抗菌生絲抑菌率的差異

圖5 接枝率與抑菌率關系圖

由圖5可知，抗菌生絲的接枝率與抑菌率呈正相關。接枝率越高，對應抗菌生絲對大腸桿菌的抑菌率越高。當接枝率大于5.8%時，對應抗菌生絲樣品的抑菌率可高達90%，當接枝率在1.4%以下時，抑菌率為0。

5.3.3 接枝率不同的抗菌生絲與TTC瓊脂混合抗菌試驗

仍取接枝率分別為16.8%、11.1%、5.8%、4.2%、1.4%和未接枝（接枝率為0%）的抗菌生絲與配制好的大腸桿菌懸液混合浸泡后，一起倒入TTC瓊脂中，編號為①～⑥號，置于37℃生化培養(yǎng)箱中過夜，待菌落產(chǎn)生后進行觀察比較，如圖6。

圖6 ①～⑥號樣品與TT C 瓊脂混合培養(yǎng)過夜后菌落生長情況

數(shù)據(jù)表明：①、②號生絲抗菌能力最強，在瓊脂上無菌落形成，抑菌率高達100%，表明經(jīng)接枝改性后的抗菌生絲對大腸桿菌具有良好的殺菌能力。

③號生絲對應平板上存在少量菌落，抑菌率可達99.4%。

④號生絲對應平板上的菌落比③號略多，表明當接枝率僅為4.2%時，抑菌率也可達70%。

⑤號的接枝率很低，平板上菌落數(shù)比加入⑤號之前更多，表明大腸桿菌在蛋白胨培養(yǎng)基中繁殖，抑菌率為0%。

⑥號為空白試驗，加入的是未接枝的生絲，大腸桿菌在蛋白胨培養(yǎng)基中繁殖，細菌濃度增大，無抑菌能力。

根據(jù)數(shù)據(jù)作出接枝率與抑菌率關系，如圖5。

如圖6所示：①～⑥號樣品經(jīng)處理后在瓊脂上均顯紅色。

①、②號樣品接枝率最大，對應生絲表面略顯紅色，生絲外的平板有少量菌落，表明①、②號樣品抑菌率最好。

③號樣品對應生絲表面呈紅色，生絲外的平板上的菌落數(shù)目比①、②號樣品多，抑菌率也低于①、②號樣品。

④、⑤、⑥號樣品對應生絲表面呈明顯紅色，表明對應抗菌生絲樣品抑菌能力較差，大腸桿菌附著在生絲表面不斷滋生。

6 結論

（1）由圖5可知，抗菌生絲的接枝率與抑菌率呈正相關。接枝率越高，對應抗菌生絲對大腸桿菌的抑菌率越高。當接枝率大于5.8%時，對應抗菌生絲樣品的抑菌率可高達90%，當接枝率在1.4%以下時，抑菌率為0。

（2）抗菌表征試驗準備過程需在無菌環(huán)境下培養(yǎng)細菌，杜絕其他細菌污染，生化培養(yǎng)箱保持恒溫37℃保存瓊脂平板和培養(yǎng)細菌，菌懸液和營養(yǎng)肉湯需3℃以下保存。

（3）將抗菌劑接枝在生絲上，并進行抗洗性實驗，證明此法接枝生絲可獲得更為安全長效的抗菌效果，有助于減少現(xiàn)代醫(yī)療中對抗生素過于依賴的情況，其抗菌過程中結構不改變，使用一定時間后只需洗滌即可除去表面吸附的細菌殘骸，恢復其抗菌性能，可循環(huán)利用，在成本上有良好優(yōu)勢。

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