孫高飛，何守樸，潘兆娥，杜雄明

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棉屬四倍體AD1與二倍體A2、D5基因組的同源SSR分析

孫高飛1,2，何守樸1，潘兆娥1，杜雄明1

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng)455000；2. 安陽(yáng)工學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與信息工程學(xué)院，安陽(yáng)455000

SSRs(Simple sequence repeats)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物基因組的DNA短串聯(lián)重復(fù)序列，是重要的基因組分子標(biāo)記。比較不同基因組同源SSR的差異，有利于了解相近物種間的進(jìn)化過(guò)程。文章使用雷蒙德氏棉基因組(D5)、亞洲棉基因組(A2)全基因組序列和陸地棉(AD1)的限制性酶切基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)行全基因組SSR掃描，比較了A組和D組的SSR分布情況，通過(guò)識(shí)別3個(gè)基因組之間的同源SSR，比較它們之間同源SSR重復(fù)序列的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組和D組同源SSR的分布規(guī)律非常相似，但A組與AD組的同源SSR保守性比D組與AD組同源SSR的保守性強(qiáng)。與AD組同源SSR相比，A組中重復(fù)序列長(zhǎng)度增長(zhǎng)的SSR數(shù)量約為長(zhǎng)度縮短的SSR數(shù)量的5倍，在D組中這一比值約為3倍。可以推測(cè)，四倍體AD組在與A組、D組的平行進(jìn)化過(guò)程中，由于基因組融合，導(dǎo)致SSR的重復(fù)序列長(zhǎng)度變化速率與二倍體A、D組有差異，同時(shí)這種差異可能導(dǎo)致了AD組SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度在進(jìn)化過(guò)程中與二倍體相比有變短的趨勢(shì)。文章首次對(duì)3個(gè)棉花基因組的同源SSR進(jìn)行了系統(tǒng)地比較，發(fā)現(xiàn)了同源SSR在棉屬四倍體基因組和二倍體基因組中的顯著差異，為進(jìn)一步揭示棉屬基因組的進(jìn)化規(guī)律提供了基礎(chǔ)。

SSR；棉花基因組；同源SSR；進(jìn)化

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeats, SSRs)又稱(chēng)微衛(wèi)星(Microsatellites)，是一類(lèi)由幾個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，基序長(zhǎng)度一般為1~6 bp，總長(zhǎng)一般大于或等于10 bp，廣泛分布于動(dòng)植物基因組，是重要的基因組分子標(biāo)記。SSR具有多態(tài)性強(qiáng)、長(zhǎng)度小、易于快速檢測(cè)等特點(diǎn)，主要應(yīng)用于動(dòng)植物的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等理論和應(yīng)用研究[1,2]。

SSR在生物進(jìn)化研究中也扮演著重要角色，在大規(guī)?；蚪M測(cè)序開(kāi)始之前，對(duì)于SSR的研究是通過(guò)PCR等實(shí)驗(yàn)方法獲得同源位點(diǎn)SSR，通過(guò)檢測(cè)序列長(zhǎng)度的差異來(lái)分析物種間的遺傳關(guān)系，研究范圍覆蓋動(dòng)物[3~6]和植物[7~10]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，完整測(cè)序的基因組越來(lái)越多，對(duì)于SSR的研究也就更加的全面和深入，基于物種之間、群體之間的SSR的比較研究不斷涌現(xiàn)[11~16]。

棉花SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)在近年獲得了快速進(jìn)步[17~19]，成為棉花分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為成功的分子標(biāo)記之一，廣泛地應(yīng)用于棉花種質(zhì)資源的遺傳多樣性[20~22]、重要農(nóng)藝性狀的QTL定位[23~25]和全基因組關(guān)聯(lián)分析等領(lǐng)域[26~28]。然而由于缺乏參考基因組，同時(shí)已開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記來(lái)源相對(duì)單一(大多數(shù)來(lái)源于纖維EST庫(kù))，因而對(duì)于棉花SSR在整個(gè)基因組上的分布和變化規(guī)律依然缺乏宏觀的認(rèn)識(shí)和研究。

通常認(rèn)為，現(xiàn)在栽培上所用的異源四倍體陸地棉(AD1)的兩個(gè)亞基因組供體種為二倍體亞洲棉(A2)和雷蒙德氏棉(D5)[29]。近年來(lái)隨著這兩個(gè)二倍體基因組草圖[30,31]和部分陸地棉基因組測(cè)序原始序列的公布[32]，人們對(duì)這3個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)了解地更加深入，但作為序列變異重要來(lái)源之一的SSR，特別是同源SSR在3個(gè)基因組之間的比較尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉3個(gè)基因組同源SSR進(jìn)行系統(tǒng)的比較和分析，重點(diǎn)探討了3個(gè)基因組之間同源SSR的差異，以及產(chǎn)生這些差異的可能原因。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

雷蒙德氏棉基因組序列(以下簡(jiǎn)稱(chēng)D組)以及相關(guān)注釋下載自NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ assembly/519268/)，亞洲棉基因組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)A組)序列以及相關(guān)注釋信息下載自http://cgp.genomics. org.cn/。由于之前報(bào)道的陸地棉遺傳圖譜編號(hào)和兩個(gè)二倍體全基因組測(cè)序編號(hào)存在差異，為了更直觀分析SSR的同源性，本文首先根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)這些編號(hào)進(jìn)行了整合[33](表1)。陸地棉基因組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)AD組)測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI中http://www.ncbi.nlm.nih. gov/bioproject/168346。該基因組測(cè)序使用6種不同的陸地棉品種和兩種不同的酶切方法，形成12個(gè)不同的測(cè)序序列樣本，在本文中以下劃線(xiàn)連接樣本名稱(chēng)和內(nèi)切酶名稱(chēng)做為陸地棉序列庫(kù)的名稱(chēng)。

另外根據(jù)全基因組測(cè)序的染色體和基因注釋信息，本文將基因組上的基因區(qū)域劃分為外顯子區(qū)(CDS)、內(nèi)含子區(qū)(intron)、5?UTR區(qū)、3?UTR區(qū)、基因上游1000 bp(1 K)、基因下游1000 bp(1K)和非編碼區(qū)(由于注釋的原因，A組沒(méi)有5?UTR區(qū)、3?UTR區(qū))。使用perl語(yǔ)言編程，定位每個(gè)SSR在A組和D組上所在的基因區(qū)域，以便對(duì)各基因區(qū)域內(nèi)包含的SSR數(shù)量進(jìn)行比較。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

1.2 全基因組SSR掃描

基于Perl的MISA程序(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)A組、D組和AD組的基因組序列進(jìn)行掃描，按照默認(rèn)參數(shù)，識(shí)別最少為10次的單堿基重復(fù)和最少5次的2、3、4、5、6堿基重復(fù)為SSR。作為一個(gè)SSR認(rèn)定的兩個(gè)重復(fù)序列之間的堿基數(shù)不超過(guò)100 bp。

表1 本研究使用的棉花染色體編號(hào)與遺傳圖譜和基因組測(cè)序的染色體編號(hào)對(duì)比

1.3 同源SSR識(shí)別

將MISA掃描獲得的數(shù)據(jù)分別建立SSR序列庫(kù)。使用perl編寫(xiě)腳本分別提取A組、D組SSR基序兩側(cè)各100 bp堿基序列，形成長(zhǎng)度超過(guò)210 bp的SSR識(shí)別序列。利用BLAST工具[34]，將同源SSR識(shí)別序列映射到目標(biāo)基因組進(jìn)行匹配。由于BLAST的比對(duì)算法會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的比對(duì)結(jié)果，在這些結(jié)果中，只有匹配長(zhǎng)度達(dá)到一定的長(zhǎng)度才能認(rèn)為兩個(gè)SSR識(shí)別序列是同源的。對(duì)于A組到D組、A組到AD組、D組到AD組的匹配記錄，以匹配長(zhǎng)度為觀察參數(shù)，以10 bp為區(qū)間，分別計(jì)算匹配長(zhǎng)度的分布(圖1)，可見(jiàn)，匹配長(zhǎng)度在190 bp位置的分布數(shù)量迅速上升?？紤]到側(cè)翼序列有200 bp，取190 bp作為匹配長(zhǎng)度，這時(shí)序列匹配度可達(dá)95%，因此選擇190 bp作為認(rèn)定SSR識(shí)別序列同源的閾值。如果A組的一個(gè)SSR (A_SSR)識(shí)別序列和D組的一段序列同源，則稱(chēng)這段序列是A_SSR識(shí)別序列在D組的同源匹配序列，如果該同源匹配序列中同時(shí)也存在一個(gè)SSR(D_SSR)，則認(rèn)為A_SSR和D_SSR為同源SSRs。從A組到D組識(shí)別同源SSRs，以及從A組到AD組、D組到AD組識(shí)別同源SSRs，均采用這一標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 同源SSR的重復(fù)序列比對(duì)

通過(guò)MISA掃描獲得的SSR重復(fù)類(lèi)型有8種：c，c*，p1，p2，p3，p4，p5，p6。其中c和c*是組合型的SSR，即由兩個(gè)或兩個(gè)以上的重復(fù)序列組成。其中c*重復(fù)序列之間沒(méi)有或只有一個(gè)其它堿基，而c類(lèi)型的SSR重復(fù)序列之間包含若干個(gè)堿基。相對(duì)于組合型SSR，簡(jiǎn)單類(lèi)型SSR是指由一個(gè)重復(fù)基序經(jīng)過(guò)多次重復(fù)形成的重復(fù)序列，pn中的n是指基序的堿基數(shù)，例如p2值基序?yàn)? bp的重復(fù)序列。

圖1 3個(gè)基因組之間SSR識(shí)別序列Blast結(jié)果中不同匹配長(zhǎng)度的數(shù)量分布

同源SSR中的重復(fù)序列總體上可以分為：重復(fù)類(lèi)型不同和重復(fù)類(lèi)型相同兩種情況。本文將針對(duì)這兩種不同的情況分別進(jìn)行分析。

1.5 同源SSR類(lèi)型差異統(tǒng)計(jì)

SSR變化的過(guò)程和機(jī)制目前還不清楚，因此，本文對(duì)于基因組之間同源SSR類(lèi)型的差異情況只通過(guò)比較不同位置的SSR類(lèi)型差異數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 同源SSR類(lèi)型相同的情況

對(duì)于類(lèi)型相同的同源SSR，本文對(duì)匹配序列的A組和D組的SSR進(jìn)行了分析，將兩個(gè)SSR序列進(jìn)行如下的分類(lèi)：(1) 兩個(gè)SSR的基序沒(méi)有發(fā)生變化，只是重復(fù)基序的次數(shù)有變化；(2) 兩個(gè)SSR的基序不同，但是這個(gè)不同是由于重復(fù)序列的起始位置的若干個(gè)堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致重復(fù)基序產(chǎn)生了堿基的滑動(dòng)，這種情況本文定義為基序移位，例如AGC和GCA，這種基序移位在比較和統(tǒng)計(jì)中認(rèn)定為是基序相同；(3) 兩個(gè)SSR的基序完全不同，例如AAT和GTC。

由于BLAST比對(duì)時(shí)，主要是以SSR兩端的側(cè)翼序列為識(shí)別序列，序列比對(duì)時(shí)已經(jīng)確定了兩個(gè)同源序列的匹配方向，因此SSR的方向應(yīng)該和同源序列的方向是一致的。如果匹配序列的方向是反向的，則需將其中一個(gè)SSR基序的互補(bǔ)序列與另外一個(gè)SSR基序進(jìn)行比較。例如基序?yàn)锳AG和CTT的兩個(gè)SSR，如果兩翼序列匹配方向是反向的，則是完全相同的基序序列，如果兩翼序列是正向匹配，則這兩個(gè)SSR基序是完全不同的。在對(duì)同源SSR進(jìn)行長(zhǎng)度對(duì)比時(shí)，將基序不同的記錄剔除，因?yàn)檫@樣的記錄中的兩個(gè)SSR不是真正同源的SSR，很可能是在同源位點(diǎn)分別進(jìn)化的SSR。

2 結(jié)果與分析

2.1 A基因組和D基因組SSR分布

以1Mb長(zhǎng)度作為區(qū)間來(lái)研究SSR在A組和D組中的分布情況，同時(shí)根據(jù)兩個(gè)基因組的注釋?zhuān)芯客瑓^(qū)間的基因分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SSR和注釋基因無(wú)論在位置還是數(shù)量上均高度一致，并且單位區(qū)間內(nèi)SSR數(shù)量和基因數(shù)量高度相關(guān)(圖2)，相關(guān)系數(shù)分別為A (=0.913***) 和D (=0.939***)。

本文在A組中定位到326664個(gè)SSR (平均~4.69 kb一個(gè))，在D組中定位到191377個(gè)SSR (平均約~3.92 kb一個(gè))。每條染色體中SSR的數(shù)量和其所在區(qū)域的長(zhǎng)度高度相關(guān)(表2)。結(jié)果顯示，外顯子區(qū)的SSR數(shù)量明顯低于其他區(qū)域，A組中的數(shù)量為2141個(gè)，而D組中SSR數(shù)量為2326個(gè)，但在與外顯子區(qū)長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)膬?nèi)含子區(qū)域，卻有將近10倍數(shù)量的SSR(A組為26 231個(gè)，D組為23 892個(gè))。由于A組的UTR 區(qū)未注釋?zhuān)谶M(jìn)行比較時(shí)，將D組的5? UTR數(shù)據(jù)合并至基因上游1 K，將3? UTR數(shù)據(jù)合并至基因下游1 K。

由于SSR的數(shù)量和所在區(qū)域的長(zhǎng)度有密切關(guān)系，為了更準(zhǔn)確地了解SSR的分布規(guī)律，本文計(jì)算了A組、D組各基因區(qū)域的長(zhǎng)度，SSR的數(shù)量和分布密度(表2)。由表2可知，CDS區(qū)SSR的密度最小，而在其他區(qū)域中，上游1 K的SSR密度最高，基因內(nèi)含子和下游1 K的SSR密度也較高，這很可能是與SSR參與基因區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[35]。

圖2 A組、D組SSR分布圖

A：A組SSR和基因在染色體上的分布；B：D組SSR和基因在染色體上的分布；C：A組單位區(qū)間內(nèi)SSR數(shù)量和基因數(shù)量的相關(guān)性；D：D組單位區(qū)間內(nèi)SSR數(shù)量和基因數(shù)量的相關(guān)性。

為了進(jìn)一步了解不同基序類(lèi)型SSR在基因組不同區(qū)域的分布特點(diǎn)，本文對(duì)A組、D組在各區(qū)域內(nèi)不同基序類(lèi)型SSR的數(shù)量所占比例進(jìn)行了比較(圖3)。A組、D組在基因上游1 K、基因下游1 K、基因內(nèi)含子和非編碼區(qū)的SSR類(lèi)型分布非常一致，不同類(lèi)型SSR所占比例從高到低依次是p1、p2、c、p3、p4、c*、p5和p6。CDS區(qū)的類(lèi)型分布則和其他區(qū)域完全不同，p3類(lèi)型占據(jù)了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)樵赟SR的多態(tài)性類(lèi)型中最常見(jiàn)的是重復(fù)序列的擴(kuò)增和縮減，在CDS中除了p3和p6外，其他類(lèi)型SSR的基序重復(fù)次數(shù)的變化，都可能導(dǎo)致基因閱讀框的變化，從而改變基因翻譯后的蛋白結(jié)構(gòu)，因此會(huì)受到進(jìn)化選擇的限制。而且由于基序長(zhǎng)度的限制，p6出現(xiàn)的概率明顯小于p3，所以p3在CDS區(qū)的比例最大。另外一個(gè)略為突出的現(xiàn)象就是在非編碼區(qū)，p2類(lèi)型的比例比其他區(qū)域略高。

表2 A組、D組各基因區(qū)域SSR的數(shù)量與密度

圖3 不同基序類(lèi)型SSR在A組、D組各基因區(qū)域的分布

2.2 A、D兩個(gè)基因組中同源SSR的分析

2.2.1 A、D基因組同源SSR的染色體分布

通過(guò)同源SSR識(shí)別方法，在A組和D組中獲得60037個(gè)同源SSR記錄，每個(gè)記錄都包含來(lái)自A組和D組的兩個(gè)同源SSR，其中57275個(gè)同源記錄都定位在組裝的染色體上(部分定位在未組裝的scaffold上)。根據(jù)同源記錄在兩個(gè)基因組染色體上的數(shù)量對(duì)應(yīng)關(guān)系，本文構(gòu)建了A組和D組SSR分布的關(guān)聯(lián)圖(圖4)。

由于SSR在染色體上的分布相對(duì)均勻，SSR及側(cè)翼序列可以看成基因組序列的部分抽樣，同源SSR的對(duì)應(yīng)關(guān)系和其在兩個(gè)基因組上的分布能夠部分反映兩個(gè)基因組中染色體的同源性。從圖4可以看出，在A組和D組的13個(gè)染色體中，大部分同源SSR分布于相應(yīng)的同源染色體上，說(shuō)明先前認(rèn)定的同源染色體是可靠的。但是A01、A03、D01、D034個(gè)染色體之間有較大的同源SSR交換，尤其是A03和D01的同源SSR數(shù)量(1709)超過(guò)了A03和D03同源SSR的數(shù)量(1015)，這說(shuō)明染色體A03與D01之間SSR發(fā)生了大量的移位，從而使其同源性更高。這4條染色體的同源關(guān)系還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

圖4 A組和D組SSR分布關(guān)聯(lián)圖

2.2.2 A、D基因組同源SSR的比較

在A組和D組60037對(duì)同源SSR中，有10903對(duì)的重復(fù)類(lèi)型不同。為了比較清晰地比較A組和D組之間的SSR的差異，本文將同源SSR記錄分為兩類(lèi)：一是同源SSR重復(fù)類(lèi)型不同的情況，一種是SSR重復(fù)類(lèi)型相同的情況。在前者中重點(diǎn)比較SSR不同類(lèi)型變化的數(shù)量，在后者中重點(diǎn)比較基序的長(zhǎng)度比較。

在10903個(gè)同源SSR記錄中，根據(jù)兩個(gè)基因組不同的重復(fù)類(lèi)型數(shù)量，比較重復(fù)類(lèi)型差異比例(表3)，可以看到組合型SSR的重復(fù)類(lèi)型差異比例最大，簡(jiǎn)單型SSR基序堿基數(shù)量越大，重復(fù)類(lèi)型差異的比例越大。A基因組中組合型SSR的重復(fù)類(lèi)型差異比例高于D組，而D組的簡(jiǎn)單型SSR的重復(fù)類(lèi)型差異比例均高于A組。

表3 A組和D組重復(fù)類(lèi)型差異的同源SSR統(tǒng)計(jì)

本文將基因組不同位置的SSR重復(fù)類(lèi)型差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表4)，CDS區(qū)SSR重復(fù)類(lèi)型差異的比例明顯偏低，不足其他區(qū)域類(lèi)型差異比例的一半。

表4 A組和D組各基因區(qū)域重復(fù)類(lèi)型差異的同源SSR分布

根據(jù)上述獲得同源SSR的方法和基序比較方法，A組和D組SSR同源且類(lèi)型相同的同源記錄有49134條，去掉其中基序不同的2441條記錄，對(duì)剩余的46693條基序相同的同源SSR記錄進(jìn)行重復(fù)序列長(zhǎng)度的比較(表5)。比對(duì)A組和D組各基因區(qū)域同源SSR的重復(fù)序列長(zhǎng)度，可以發(fā)現(xiàn)，在CDS區(qū)的SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度相等的比例是最大的，達(dá)到48.8%，在其他的位置，A組SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度大于D組SSR重復(fù)序列的數(shù)量，要比小于D組的比例多10%左右。

表5 A組與D組各基因區(qū)域的基序相同的同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度比較

注：*表中長(zhǎng)度差為均值。

為了解基序相同的同源SSR的重復(fù)序列長(zhǎng)度和重復(fù)類(lèi)型是否存在關(guān)系，本研究比較了A組和D組各重復(fù)類(lèi)型基序相同的同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度和重復(fù)類(lèi)型(表6)。組合型的SSR長(zhǎng)度相等的比例遠(yuǎn)低于其他類(lèi)型，這說(shuō)明組合型類(lèi)型SSR在兩個(gè)基因組間變化很大。在簡(jiǎn)單型SSR中，A組中p1類(lèi)型SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度大于D組的數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)長(zhǎng)度小于的數(shù)量(41.02%：28.52%)，其他類(lèi)型在A組SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度大于D組SSR和A組SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度小于D組，在比例上總體相當(dāng)。不同重復(fù)類(lèi)型SSR所表現(xiàn)的重復(fù)長(zhǎng)度差異沒(méi)有明顯的規(guī)律。

表6 A組與D組各重復(fù)類(lèi)型的基序相同的同源SSR長(zhǎng)度比較

2.3 A組、D組和AD組SSR同源關(guān)系比較

2.3.1 總體比較

本研究使用A組SSR識(shí)別序列和D組SSR識(shí)別序列，分別對(duì)陸地棉(AD組)12個(gè)樣本的測(cè)序序列進(jìn)行了匹配定位，確定A組、D組和AD組的同源SSR。由于12個(gè)樣本中的MCU_5_HpaII讀段數(shù)量不足其他樣本數(shù)量的1/3，導(dǎo)致與其他數(shù)據(jù)比較有較大差異，因此在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，剔除了樣本MCU_5_HpaII的數(shù)據(jù)。

為了便于說(shuō)明，本文將3個(gè)基因組之間的同源SSR關(guān)系繪制成圖(圖5)，A組中和AD同源的SSR稱(chēng)為A-AD同源SSR；D組中和AD組同源的SSR，稱(chēng)為D-AD同源SSR。同理，AD組中和A組同源的SSR，稱(chēng)為AD-A同源SSR，AD組中和D組同源的SSR，稱(chēng)為AD-D同源SSR。

將AD組SSR分成3個(gè)部分：只和A組SSR同源的，稱(chēng)為AD-A特有同源SSR；只和D組SSR同源的，稱(chēng)為AD-D特有SSR；和A、D組均有同源SSR的稱(chēng)為共有同源AD組SSR。

AD-A同源SSR數(shù)量=AD-A特有同源SSR數(shù)量+共有同源AD組SSR數(shù)量；

AD-D同源SSR數(shù)量=AD-D特有同源SSR數(shù)量+共有同源AD組SSR數(shù)量；

依據(jù)以上的定義，A-AD同源SSR數(shù)量平均是D-AD同源SSR數(shù)量的2.76倍，而AD-A同源SSR的數(shù)量平均是AD-D組同源SSR數(shù)量的1.3倍，AD-A特有SSR的數(shù)量平均是AD-D特有SSR數(shù)量的1.61倍。

圖5 3個(gè)基因組SSR同源關(guān)系圖

2.3.2 3個(gè)基因組基序相同的同源SSR長(zhǎng)度比較

分別對(duì)A組和AD組、D組和AD組的基序相同的同源SSR的重復(fù)序列長(zhǎng)度進(jìn)行了比較，計(jì)算了比較后A組、D組SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度小于、等于和大于AD組同源SSR記錄的數(shù)量比例(表8)，并分別計(jì)算了同源SSR之間的重復(fù)序列長(zhǎng)度差的平均值。

為驗(yàn)證3個(gè)基因組之間基序相同的同源SSR長(zhǎng)度差異是否顯著，分別對(duì)3個(gè)基因組之間的SSR長(zhǎng)度做了檢驗(yàn)，其中A組和D組的同源SSR數(shù)量為60036對(duì)，檢驗(yàn)值為3.97E-20，說(shuō)明兩個(gè)基因組SSR長(zhǎng)度差異極為顯著，A組和AD組、D組和AD組的SSR長(zhǎng)度差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果同樣是極為顯著(表8)。

A組和AD組同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度相等的數(shù)量高于D組和AD組同源SSR長(zhǎng)度相等的數(shù)量比例，同時(shí)，A組和AD組同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度不同時(shí)的長(zhǎng)度差小于D組和AD組同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度不同時(shí)的長(zhǎng)度差。

本文對(duì)A、D組各基因區(qū)域的SSR和AD組同源SSR的重復(fù)序列長(zhǎng)度比較結(jié)果進(jìn)行分別統(tǒng)計(jì)(圖6)。首先，無(wú)論A組和D組，重復(fù)序列長(zhǎng)度大于AD組同源SSR的數(shù)量比例，遠(yuǎn)超過(guò)重復(fù)序列長(zhǎng)度小于AD組同源SSR的數(shù)量比例；其次，在外顯子區(qū)域，A、D組和AD組重復(fù)序列長(zhǎng)度相等的同源SSR比例最高，說(shuō)明SSR在外顯子區(qū)域在3個(gè)棉種之間都非常保守；最后，A、D組重復(fù)序列長(zhǎng)度小于AD組同源SSR的數(shù)量在各基因區(qū)域都比較接近。

表7 A組、D組和AD組同源SSR數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表8 基序相同的同源SSR長(zhǎng)度比較

圖6 A組、D組和AD組各基因區(qū)域同源SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度對(duì)比

3 討 論

本研究中3個(gè)基因組雖然同屬于棉屬，但是在基因組大小上有較大的差異，且AD基因組的測(cè)序方法與A組、D組的測(cè)序方法有所不同。要保證3個(gè)基因組間的SSR能夠進(jìn)行可信的比較，需要選取3個(gè)基因組中高度同源的SSR記錄。

本研究使用SSR及兩側(cè)側(cè)翼序列各100 bp作為識(shí)別序列到目標(biāo)基因組進(jìn)行匹配，并要求匹配長(zhǎng)度大于等于190 bp，這一匹配要求是非常嚴(yán)格的(實(shí)驗(yàn)使用的PCR引物長(zhǎng)度一般為20~30 bp)，滿(mǎn)足匹配條件的兩個(gè)識(shí)別序列具有高度的同源性。同時(shí)對(duì)于匹配到的同源序列，要求其必須同樣具有SSR重復(fù)序列，這進(jìn)一步保證了匹配序列為高度同源的SSR序列。由于比較只在同源SSR間進(jìn)行，因此能夠避免基因組大小、染色體倍數(shù)和測(cè)序手段差異對(duì)研究結(jié)果的影響，最大限度保證了研究結(jié)果的可靠性。

在對(duì)同源SSR記錄進(jìn)行重復(fù)序列長(zhǎng)度比較之前，先對(duì)SSR基序進(jìn)行了比對(duì)，剔除了基序不同的同源SSR記錄，因此，最后進(jìn)行SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度比較的同源SSR記錄，其最主要差異就是重復(fù)序列長(zhǎng)度的差異，這部分同源記錄中的SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度的變化保留了3個(gè)基因組在進(jìn)化過(guò)程中留下的SSR重復(fù)序列長(zhǎng)度變化的痕跡。

3.1 3個(gè)基因組CDS區(qū)的SSR非常保守

比較A組和D組SSR發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在不同基因區(qū)域的SSR密度，還是不同重復(fù)類(lèi)型SSR在基因區(qū)域所占的比例都非常接近。A組和D組CDS區(qū)重復(fù)類(lèi)型有差異的SSR比例不到其他基因區(qū)域比例的一半(表4)，在基序相同的同源SSR中，CDS區(qū)域長(zhǎng)度相等的比例是其他區(qū)域的兩倍多(表5)，這些數(shù)據(jù)均說(shuō)明A組和D組在CDS區(qū)域的同源SSR比其他區(qū)域保守得多。

A組和AD組比較，CDS區(qū)域長(zhǎng)度相等的SSR所占比例為63.6%，D組和AD組比較，同源長(zhǎng)度相等SSR所占比例為57.8%，約是其他區(qū)域的兩倍(圖6)。這也說(shuō)明，3個(gè)基因組CDS區(qū)域SSR的保守型都要遠(yuǎn)高于其他區(qū)域。

同時(shí)，各基因組CDS區(qū)域的SSR數(shù)量明顯小于其他區(qū)域。以上現(xiàn)象可能是因?yàn)镾SR的高度可變性容易導(dǎo)致外顯子區(qū)閱讀框的改變，從而影響基因的功能，由于進(jìn)化的選擇，大量CDS區(qū)域的SSR被淘汰并趨于穩(wěn)定，從而導(dǎo)致外顯子區(qū)SSR的高度保守[36,37]，這與已有研究的結(jié)果是相符的[8,38]。

3.2 就同源SSR數(shù)量和長(zhǎng)度變化而言，A組在同源性上比D組更接近AD組

A組的SSR數(shù)量約是D組SSR數(shù)量的1.8倍(表2)，A-AD同源SSR數(shù)量約是D-AD同源SSR數(shù)量的2.76倍(表7)，這說(shuō)明和D組相比，A組中SSR中有更高的比例與AD組同源的SSR。

同樣，AD-A組同源SSR是AD-D同源SSR的1.3倍，而特有的AD-A同源SSR是特有AD-D同源SSR的1.6倍(表7)，這說(shuō)明AD組和A組同源的SSR數(shù)量明顯高于和D組同源SSR數(shù)量。A組和D組的SSR的分布規(guī)律是非常相似的，因此，如果把SSR所在序列看成基因組的抽樣，可以推測(cè)，A組和AD組的SSR同源性高于D組和AD組的SSR同源性。另外，在同源且類(lèi)型相同的SSR記錄中，A組和AD組同源SSR長(zhǎng)度相同的比例(41.8%)要高于D組和AD組同源SSR長(zhǎng)度相同的比例(37.5%)(表8)，這說(shuō)明A組和AD組的同源SSR保守性比D組和AD組的同源SSR保守性更高，這從另一個(gè)方面也印證了上述結(jié)論。

A組小于AD組同源SSR的平均長(zhǎng)度差為-4.15，而D組小于AD組同源SSR的平均長(zhǎng)度差為-4.81；A組大于AD組同源SSR的平均長(zhǎng)度差為6.4，而D組大于AD組同源SSR的平均長(zhǎng)度差為7.72(表8)。D組與AD組的同源SSR長(zhǎng)度差均大于A組和AD組同源SSR的長(zhǎng)度差，這也是A組與AD組的SSR同源性高于D組與AD組的SSR同源性的又一個(gè)佐證。

3.3 AD組和A、D組相同基序的同源SSR長(zhǎng)度變化的數(shù)量差異

A組和D組來(lái)自共同的祖先，而AD組是A組和D組融合加倍而成，3個(gè)基因組是平行進(jìn)化的[30]。根據(jù)同源SSR的長(zhǎng)度比較，A組小于D組和A組大于D組的SSR數(shù)量比例基本是相等的(表6)，但是，A組SSR長(zhǎng)度大于AD組同源SSR長(zhǎng)度的SSR數(shù)量，約是A組SSR長(zhǎng)度小于AD組同源SSR長(zhǎng)度的SSR數(shù)量的5倍，D組和AD組比較的結(jié)果約為3倍(表8)。產(chǎn)生這種情況，有兩種可能：一種情況是A組和D組相對(duì)于AD組，大量SSR的長(zhǎng)度增長(zhǎng)了；另一種是AD組和A組、D組相比，大量SSR的長(zhǎng)度縮短了。無(wú)論是哪一種情況，都可以認(rèn)為，AD組的SSR長(zhǎng)度變化速率與A、D組是不同的，而且，這種變化具有傾向性(多數(shù)SSR傾向于增長(zhǎng)，或者縮短)，因?yàn)橹挥羞@種傾向性，才有可能導(dǎo)致目前本文獲得的3個(gè)基因組之間SSR長(zhǎng)度差異情況。

關(guān)于人和黑猩猩[39]、羊和牛[3]的相近物種SSR長(zhǎng)度差異現(xiàn)象很早就被提出，之后這種差異被解釋為是由于測(cè)量偏差(Ascertainment bias)而導(dǎo)致的，同時(shí)也有觀點(diǎn)認(rèn)為測(cè)量偏差不能完全解釋人和黑猩猩之間SSR的長(zhǎng)度差異[40]。后來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)除了兩堿基重復(fù)的SSR的長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于黑猩猩之外，其他重復(fù)類(lèi)型的SSR沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，而單堿基重復(fù)還發(fā)現(xiàn)了相反的趨勢(shì)[4]。上述研究從不同的角度研究了相近物種之間的同源SSR長(zhǎng)度差異，認(rèn)為相近物種之間導(dǎo)致SSR長(zhǎng)度差異的原因很可能是因?yàn)橥蛔兯俾蚀嬖诓町怺11]。

由于本研究直接使用SSR側(cè)翼序列匹配來(lái)獲得同源SSR，側(cè)翼兩端序列長(zhǎng)度取值達(dá)到200 bp，匹配長(zhǎng)度不小于190 bp，因此獲得的同源SSR序列的同源堿基比例超過(guò)95%。同時(shí)，本研究是使用統(tǒng)一的條件來(lái)獲得3個(gè)基因組內(nèi)所有的同源SSR，不屬于抽樣調(diào)查，因此本身可以排除測(cè)量偏差。在高度同源的SSR對(duì)比中，AD組的SSR長(zhǎng)度與A組、D組相比，變長(zhǎng)的SSR數(shù)量遠(yuǎn)低于變短的SSR數(shù)量?？紤]到A、D組的SSR長(zhǎng)度差異的數(shù)量比例比較接近，而且它們都是二倍體，而AD組是四倍體，這是和A、D組最為明顯的差異。因此這種SSR長(zhǎng)度變化在數(shù)量的差異，很有可能與AD組是四倍體而A、D基因組是二倍體有關(guān)。本文推測(cè)由于AD組是A、D基因組的融合，而這種融合過(guò)程導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度變化速率的差異，而且這種差異導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度變化的傾向性(大部分的SSR傾向于增長(zhǎng)或縮短)，進(jìn)而形成了現(xiàn)有的AD組中大量的SSR長(zhǎng)度小于A、D組同源SSR的現(xiàn)象。

在進(jìn)化過(guò)程中，SSR的長(zhǎng)度受復(fù)制滑動(dòng)事件和點(diǎn)突變等多因素影響[41,42]，因此A、D組中大量SSR相對(duì)于AD組同源SSR同步增長(zhǎng)的概率要比AD組部分SSR的長(zhǎng)度縮短的概率小，因此本文推測(cè)，四倍體的棉花AD組SSR相對(duì)于二倍體的A、D組同源SSR具有長(zhǎng)度變短的傾向性。

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(責(zé)任編委: 劉寶)

Homologous simple sequence repeats (SSRs) analysis in tetraploid (AD1) and diploid (A2, D5) genomes of

Gaofei Sun1,2, Shoupu He1, Zhaoe Pan, Xiongming Du1

Simple sequence repeats (SSRs)are a class of repetitive DNA sequences, which are commonly used for genome analysis. Comparison of the homologous SSRs among different genomes is helpful to understand the evolutionary process in relative species. In this study, SSR scanning was performed to investigate their distribution and length variation among the genomes of(D5),(A2) and(AD1). The results demonstrated that the distribution of SSRs in A genome was very similar with that in D genome, while the length variation of homologous SSRs between A and AD genome was more conserved than that between D and AD genome. Compared with SSRs in AD genome, the number of SSRs with longer motif length in A genome was about five times of those with shorter motif length, while it was about three times in D genome. This implied that the length variation rates of homologous SSRs between diploid cotton and tetraploid cotton were different during the parallel evolution due to the subgenome fusion, and the motif length of most SSRs in tetraoploid genome tended to become shorter than homologous SSRs in diploid genome during the process of evolution. This study comprehensively compared the SSRs in three cotton genomes and revealed the significant difference among them, providing a foundation for further evolutionary study ofgenome.

SSR; cotton genome; homologous SSR; evolution

2014-08-15;

2014-09-24

“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013BAD01B03)和科技部、財(cái)政部國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(編號(hào)：2012-014)資助

孫高飛，博士，副教授，研究方向：棉花生物信息學(xué)。E-mail: sungaofei@sina.com何守樸，碩士，助理研究員，研究方向：棉花種質(zhì)資源學(xué)。E-mail: zephyr0911@126.com孫高飛和何守樸并列第一作者。

杜雄明，博士，研究員，研究方向：棉花種質(zhì)資源學(xué)。E-mail: dujeffrey8848@hotmail.com

10.16288/j.yczz.14-274

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2014-12-15 8:49:34

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