吳日，馬超，李曉丹，段會(huì)坤，姬艷麗，王宇，姜蘋哲，王海松，屠培培，李淼，尼鋼鋼，馬百成，李明剛

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長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母的構(gòu)建及其對(duì)糖尿病模型小鼠的治療效果

吳日1，馬超1，李曉丹1，段會(huì)坤1，姬艷麗1，王宇1，姜蘋哲1，王海松1，屠培培1，李淼1，尼鋼鋼1，馬百成2，李明剛1

1. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部生物活性材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；2. 天津市兒童醫(yī)院，天津 300074

益生菌生物藥物是指通過(guò)口服表達(dá)藥用多肽(蛋白)的重組益生菌活細(xì)胞達(dá)到治療疾病的新型口服給藥系統(tǒng)。為了構(gòu)建一種能有效防治2型糖尿病的酵母生物藥物，文章首先構(gòu)建了釀酒酵母()整合型表達(dá)載體pNK1-PGK，并且通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)證明其表達(dá)功能正常，利用該載體將GLP-1 (Glucagon-like peptide-1)基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVSc1中，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型和Western blotting成功篩選出表達(dá)10′GLP-1的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(Long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast,LHY)。該酵母生長(zhǎng)迅速，外源基因GLP-1表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量達(dá)到1.56 mg/g細(xì)胞濕重。通過(guò)鏈脲佐菌素和高脂高糖飲食聯(lián)合誘導(dǎo)的方法構(gòu)建了2型糖尿病小鼠模型，用LHY對(duì)其進(jìn)行口服灌胃治療，證明LHY具有較好療效，明顯降低血糖水平。

2型糖尿??；胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)；長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)；重組釀酒酵母；糖尿病小鼠模型

糖尿病是由內(nèi)分泌和代謝失調(diào)導(dǎo)致的一種慢性疾病，主要臨床表現(xiàn)是“三多一少”，并且血糖表現(xiàn)出異常升高。糖尿病還會(huì)導(dǎo)致一些并發(fā)癥，如心腦血管疾病、腎臟疾病、眼部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，嚴(yán)重危害人體的健康。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率也在逐年升高，并且增長(zhǎng)速度越來(lái)越快。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，2013年世界糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到3.82億人，預(yù)計(jì)2035年將達(dá)到5.92億人[1]。我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)一億人，成為世界糖尿病第一大國(guó)[2]。因此，研發(fā)合理有效的糖尿病治療藥物，已經(jīng)成為全球的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。2型糖尿病是一種進(jìn)行性疾病，僅使用二甲雙胍等化學(xué)藥物很難長(zhǎng)期控制患者糖化血紅蛋白(HbA1c)上升，胰腺β細(xì)胞功能會(huì)以每年4%的速度進(jìn)行性衰退。因此，研發(fā)服用方便、能改善β細(xì)胞功能、持久控制血糖的藥物極為重要。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由腸道L細(xì)胞分泌的一種腸促胰島素激素，其活性形式由30個(gè)氨基酸組成。研究證明，GLP-1對(duì)2型糖尿病具有獨(dú)特的治療作用，具有葡萄糖濃度依賴性降糖作用，還可以保護(hù)胰腺β細(xì)胞，延緩2型糖尿病發(fā)展[3]。首個(gè)GLP-1類似肽“艾塞那肽注射液”已由美國(guó)FDA(Food and drug administration)和中國(guó)SFDA(State food and drug administration)同時(shí)批準(zhǔn)上市。但長(zhǎng)期打針注藥會(huì)給患者身心帶來(lái)諸多痛苦和不便，難以被糖尿病患者廣泛接受。

南開(kāi)大學(xué)生物技術(shù)與新藥實(shí)驗(yàn)室率先克隆了抗二肽基肽酶IV(DPP-IV)和胰蛋白酶降解的重組口服長(zhǎng)效基因(recombinant oral long-acting GLP-1,)，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌()、畢赤酵母()等不同宿主的高效表達(dá)，已證明其具有良好的口服降血糖效果[4, 5]。隨著糖尿病等慢性疾病的流行和快速發(fā)展，用益生菌活細(xì)胞作為緩釋“膠囊”的新型給藥系統(tǒng)正悄然興起，給糖尿病患者帶來(lái)了康復(fù)的希望。釀酒酵母()是一種食用最為安全的益生菌，其本身富含維生素、消化酶，能調(diào)節(jié)腸胃功能并對(duì)消化酶降解具有一定抵抗作用，從而對(duì)其內(nèi)容物可起到緩釋“膠囊”的作用[6]。

本研究利用前期克隆的10拷貝串聯(lián)的基因(GLP-1)[7]，以釀酒酵母作為宿主細(xì)胞，通過(guò)整合型表達(dá)載體pNK1-PGK將GLP-1轉(zhuǎn)入釀酒酵母進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，制備表達(dá)GLP-1的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(Long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast,LHY)，并研究其對(duì)2型糖尿病的治療作用。

1 材料和方法

1.1 材料

pNK1-TPI載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，具體構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]；大腸桿菌DH5α、釀酒酵母INVSc1、載體pMD-T-10×GLP-1和pMD-T-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體YEpPGK由Watanabe惠贈(zèng)；小鼠C57BL/6購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-sy5y細(xì)胞系購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC)；rolGLP-1由本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌中表達(dá)純化獲得，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pNK1-PGK的構(gòu)建

利用pNK1-TPI作為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建pNK1-PGK載體。pNK1-TPI是一個(gè)穿梭質(zhì)粒，具有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)()和氨芐青霉素抗性基因(AP)，可在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增(圖1A)。該質(zhì)粒具有一個(gè)基因，其編碼產(chǎn)物可使釀酒酵母INVS1在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以便進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選；還具有一個(gè)釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)表達(dá)單元，可使目的基因在TPI啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行表達(dá)。此外，該載體還含有兩段釀酒酵母的rDNA同源序列AB和CD，它們可以通過(guò)同源重組的方式將基因和TPI表達(dá)單元整合到釀酒酵母的基因組中，從而使目的基因穩(wěn)定表達(dá)。

為進(jìn)一步提高目的基因的表達(dá)效率，本文使用強(qiáng)啟動(dòng)子PGK表達(dá)單元替換pNK1-TPI載體中的TPI表達(dá)單元，構(gòu)建了高效整合型表達(dá)載體pNK1-PGK(圖1B)。首先根據(jù)釀酒酵母磷酸甘油酸激酶(PGK)表達(dá)單元的序列設(shè)計(jì)引物，并且分別在5￠和3￠端加入Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，引物序列為：

上游引物：5￠-GGTACCAGGAGCTTGGAAAG-ATG-3￠；

下游引物：5￠-TCTAGAGACCAGCTTTAACG-A--ACGC-3￠。

以載體YEpPGK為模板，使用不同的復(fù)性溫度(52℃、53℃、54℃和55℃)進(jìn)行梯度PCR，擴(kuò)增得到PGK表達(dá)單元，然后將PGK表達(dá)單元與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從轉(zhuǎn)化平板上挑取4個(gè)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，然后通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，隨后提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定。

用Ⅰ和Ⅰ酶切PGK表達(dá)單元，再將酶切后的PGK表達(dá)單元與經(jīng)過(guò)相同內(nèi)切酶酶切的載體pNK1-TPI連接，構(gòu)建得到載體pNK1-PGK。

1.2.2 表達(dá)載體pNK1-PGK-GFP和pNK1-PGK-10× rolGLP-1的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅱ酶切載體pMD-T-GFP，回收得到GFP編碼序列，然后將其與經(jīng)過(guò)HⅠ酶切的pNK1-PGK連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從轉(zhuǎn)化平板上挑取6個(gè)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，然后通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，隨后提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出正向連接的表達(dá)載體pNK1-PGK-GFP。

圖1 表達(dá)載體pNK1的結(jié)構(gòu)圖譜

A：pNK1-TPI載體結(jié)構(gòu)圖譜；B：pNK1-PGK載體結(jié)構(gòu)圖譜。

同樣，使用HⅠ酶切載體pMD-T-10×GLP-1，回收得到10×GLP-1編碼序列，然后將其與經(jīng)過(guò)HⅠ酶切的pNK1-PGK連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，從轉(zhuǎn)化平板上挑取6個(gè)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，然后通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，隨后提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出正向連接的表達(dá)載體pNK1-PGK- 10×GLP-1。

1.2.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

使用CaCl2制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞并轉(zhuǎn)化，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.4 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化和重組蛋白的檢測(cè)

釀酒酵母INVSc1感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。pNK1-PGK- 10′rolGLP-1轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，使用尿嘧啶缺陷型固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化3~4 d后平板上長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落到液體篩選培養(yǎng)基中30℃、200 r/min培養(yǎng)24~48 h，然后接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~48 h，離心收集20 mg左右的菌體，用酵母裂解液處理后，吸取20 μL裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，用GLP-1抗體通過(guò)Western blotting檢測(cè)不同酵母轉(zhuǎn)化子中10′rolGLP-1的表達(dá)情況[11]。

1.2.5 穩(wěn)定性檢測(cè)

釀酒酵母的代時(shí)為1~3 h[12]。INVSc1作為一種快速增長(zhǎng)的釀酒酵母，其代時(shí)約為120 min，即每24 h約為10代，參照以上標(biāo)準(zhǔn)，將新構(gòu)建的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母168(laGLP-1 hypoglycemic yeast，LHY168)接種于YPD培養(yǎng)基中，每隔2 d轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基。每隔24 h取樣，稀釋后涂布YPD固體培養(yǎng)基，待菌落長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取同一菌落分別點(diǎn)種于YPD固體培養(yǎng)基和尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，觀察兩個(gè)平板上菌落的生長(zhǎng)情況，計(jì)算未丟失外源基因的酵母菌落數(shù)占總菌落數(shù)的百分比。按照相同方法每隔24 h挑取一次，共挑取5次。

1.2.6 療效學(xué)研究

對(duì)C57BL/6小鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)和高脂高糖飲食聯(lián)合誘導(dǎo)的方法構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型[13]，然后分組并進(jìn)行治療。治療方案如下：正常組(8只)，口服1 mL生理鹽水/d；藥物治療組(6只)，口服300 mg二甲雙胍/kg/d；陰性對(duì)照組(6只)，口服1 mL生理鹽水/d；非重組酵母飼喂組(6只)，口服6 g非重組酵母/kg/d；重組酵母飼喂組(6只)，口服6 g重組酵母/kg/d(約9.36 mg rolGLP-1/kg/d)。連續(xù)口服治療16 d，期間每隔一段時(shí)間測(cè)量小鼠的體重、攝食量、飲水量和血糖水平。

1.2.7 MTT法檢測(cè)rolGLP-1對(duì)細(xì)胞活性的影響

將細(xì)胞分為調(diào)零對(duì)照組(Blank)、空白對(duì)照組(PBS)、陰性對(duì)照組(200 μmol/L 30% H2O2)、陽(yáng)性對(duì)照組(1 μmol/L BSA)、實(shí)驗(yàn)組1(1 nmol/L rolGLP-1)、實(shí)驗(yàn)組2(500 nmol/L rolGLP-1)和實(shí)驗(yàn)組3(1 μmol/L rolGLP-1)，每組5孔細(xì)胞。除了Blank組，其余各組按照1.2×105細(xì)胞/mL密度接種細(xì)胞到96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2.4×104細(xì)胞/孔(200 μL)，每孔加入不同劑量的相應(yīng)處理物質(zhì)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后每孔加20 μL MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4~6 h后，每孔加入100 μL DMSO，再在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)全部溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度。

1.2.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)rolGLP-1對(duì)細(xì)胞活性的影響

將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(PBS)、陰性對(duì)照組(200 μmol/L 30% H2O2)、陽(yáng)性對(duì)照組(1 μmol/L BSA)、實(shí)驗(yàn)組1(1 nmol/L rolGLP-1)、實(shí)驗(yàn)組2(500 nmol/L rolGLP-1)和實(shí)驗(yàn)組3(1 μmol/L rolGLP-1)，每組3孔細(xì)胞，各按照1.2×105細(xì)胞/mL密度接種細(xì)胞到96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2.4×104細(xì)胞/孔(200 μL)，每孔加入不同劑量的相應(yīng)處理物質(zhì)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后吸去培養(yǎng)基用DMEM洗一遍，Trypsin 37℃消化15 min，每孔約加20 μL臺(tái)昐藍(lán)(Trypan Blue)染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE) 計(jì)量，數(shù)據(jù)采用SPSS V13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差異采用檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pNK1-PGK的構(gòu)建與功能檢測(cè)

2.1.1 PGK表達(dá)單元的克隆

以質(zhì)粒YEpPGK為模板，PCR擴(kuò)增PGK表達(dá)單元(約1000 bp)，結(jié)果如圖2A所示，不同復(fù)性溫度均能擴(kuò)增出1000 bp左右的特異性條帶，但綜合考慮，選取55℃作為擴(kuò)增PGK表達(dá)單元的最佳復(fù)性溫度。將PCR擴(kuò)增得到的PGK表達(dá)單元與T載體連接，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖2B所示，只有4號(hào)泳道樣品擴(kuò)增出1000 bp左右的特異性條帶，初步鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取4號(hào)樣品質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2C)，酶切得到1000 bp左右的特異性條帶，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明序列完全正確，說(shuō)明已經(jīng)成功克隆了PGK表達(dá)單元，并將其插入T載體中，構(gòu)建了pMD-T-PGK載體。

2.1.2 表達(dá)載體pNK1-PGK的構(gòu)建

菌液PCR鑒定構(gòu)建的pNK1-PGK如圖2D所示，2、3、4、6和7號(hào)泳道樣品分別擴(kuò)增出1000 bp左右的特異性條帶，初步鑒定成功構(gòu)建了pNK1-PGK。提取4個(gè)樣品質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2E所示，2、3、5、7、9號(hào)泳道5個(gè)樣品酶切得到1000 bp左右的特異性條帶，說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建了表達(dá)載體pNK1-PGK。

2.1.3 表達(dá)載體pNK1-PGK的功能檢測(cè)

首先構(gòu)建表達(dá)載體pNK1-PGK-GFP，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖2F所示，6個(gè)樣品都擴(kuò)增出700 bp左右的特異性條帶，初步鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)選取4個(gè)樣品提取質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2G所示，2號(hào)和4號(hào)泳道樣品酶切得到700 bp左右的特異性條帶，為正向連接，3號(hào)和5號(hào)泳道樣品酶切得到1400 bp左右的條帶，為反向連接。將正向連接的載體pNK1-PGK-GFP轉(zhuǎn)化入釀酒酵母INVSc1，用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，結(jié)果如圖2H所示?？梢钥闯觯亟M釀酒酵母在紫外激發(fā)光下可發(fā)出不同強(qiáng)度的綠色熒光，說(shuō)明pNK1-PGK表達(dá)載體在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)能夠正常行使功能，可以用于異源蛋白的表達(dá)。

圖2 表達(dá)單元克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及功能檢測(cè)結(jié)果

A：PGK表達(dá)單元梯度PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果。泳道1: 200 bp DNA Marker；泳道2~5：不同復(fù)性溫度的PCR產(chǎn)物。B：pMD-T-PGK菌液PCR鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~5：樣品1、2、3、4菌液PCR產(chǎn)物；泳道6：陽(yáng)性對(duì)照。C：pMD-T-PGK雙酶切鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~4：pMD-T-PGK雙酶切產(chǎn)物。D：pNK1-PGK菌液PCR鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~7：1~6號(hào)樣品菌液PCR產(chǎn)物；泳道8：陰性對(duì)照；泳道9：陽(yáng)性對(duì)照。E：pNN1-PGK酶切鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2、3、5、7、9：質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；泳道4、6、8、10：質(zhì)粒對(duì)照；泳道11：陽(yáng)性對(duì)照。F：pNK1-PGK-GFP的菌液PCR鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~7：1~6號(hào)樣品菌液PCR產(chǎn)物；泳道8：陽(yáng)性對(duì)照；泳道9：陰性對(duì)照。G：pNK1-PGK-GFP雙酶切鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~5：載體pNK1-PGK-GFP酶切產(chǎn)物。H：轉(zhuǎn)入pNK1-PGK-GFP的重組酵母在白光和紫外激發(fā)光下的顯微照相結(jié)果。1：白光照射下的重組酵母；2：紫外光照射下的重組酵母。

2.2 長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)的構(gòu)建和篩選

2.2.1 表達(dá)載體pNK1-PGK-10′GLP-1的構(gòu)建

表達(dá)載體pNK1-PGK-10′GLP-1菌液PCR鑒定結(jié)果如圖3A所示，1~4號(hào)樣品擴(kuò)增出1000 bp左右的特異性條帶，初步鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。分別提取4個(gè)樣品的質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3B所示，3號(hào)泳道的1號(hào)樣品酶切得到700 bp左右的特異性條帶，為正向連接，4號(hào)泳道的2號(hào)樣品酶切得到1700 bp左右的條帶，為反向連接，選取正向連接的載體進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

圖3 表達(dá)載體pNK1-PGK-10′GLP-1的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果

A：pNK1-PGK-10′GLP-1的菌液PCR鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道2~7：1~6號(hào)樣品的菌液PCR產(chǎn)物；泳道8：陽(yáng)性對(duì)照；泳道9：陰性對(duì)照。B：pNK1-PGK-10′GLP-1酶切鑒定結(jié)果。泳道1：200 bp DNA Marker；泳道3~6：1~4號(hào)樣品酶切產(chǎn)物。C：重組釀酒酵母的GLP-1抗體Western blotting檢測(cè)結(jié)果。負(fù)對(duì)照：未轉(zhuǎn)化載體pNK1-PGK-10GLP-1的釀酒酵母裂解物；樣品1~4：轉(zhuǎn)化載體pNK1-PGK-10GLP-1的重組釀酒酵母裂解物；正對(duì)照：10′GLP-1純化樣品。

2.2.2 10′rolGLP-1重組酵母的篩選

Western blotting檢測(cè)結(jié)果如圖3C所示，樣品1、3和4中均有10′GLP-1表達(dá)，說(shuō)明本研究成功篩選到了能夠表達(dá)10′GLP-1的重組釀酒酵母，其中樣品1表達(dá)量較高，將其命名為長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母168(laGLP-1 hypoglycemic yeast, LHY168)，用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果如表1所示，10′GLP-1已經(jīng)整合到了釀酒酵母基因組中，外源基因保存率100%，可以進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳。

表1 重組釀酒酵母穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母LHY168按照1:100的比例接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，每隔8 h取樣測(cè)量600，繪制LHY168的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明LHY168的生長(zhǎng)狀況良好，其生長(zhǎng)曲線與非重組酵母的生長(zhǎng)曲線基本一致(圖略)，表明GLP-1基因的引入未影響酵母的正常生長(zhǎng)和功能。

使用酵母裂解液裂解重組釀酒酵母LHY168，提取胞內(nèi)蛋白，然后使用ELISA雙抗體夾心法測(cè)量GLP-1的表達(dá)量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖略)測(cè)得長(zhǎng)效促胰島素GLP-1的表達(dá)量為1.56 mg/g細(xì)胞濕重。

2.3 長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)對(duì)2型糖尿病小鼠的治療作用

2.3.1 2型糖尿病小鼠模型的構(gòu)建

本研究采用高脂高糖飲食聯(lián)合注射STZ的方法誘導(dǎo)小鼠成2型糖尿病模型，給小鼠連續(xù)注射3次STZ以后，小鼠體重發(fā)生了明顯變化，如圖4A所示。正常組小鼠體重從造模前的24.9±1.48 g增加到25.85±1.67 g，增加不明顯，而糖尿病組小鼠體重從造模前的26.66±2.12 g降低到24.84±1.72 g(<0.05)，下降了6.82%。

造模前后小鼠的攝食量也發(fā)生了明顯變化，如圖4B所示。正常組小鼠攝食量，由原來(lái)每天的3.12±0.1 g/d增加到3.84±0.7 g/d，攝食量增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病組的小鼠的攝食量也由原來(lái)的3.89±0.1 g/d增加到5.66±0.1 g/d (<0.05)，增加了45.5%，相比之下糖尿病組小鼠的攝食量顯著高于對(duì)照組(<0.01)，大約提高47.4%。

造模后小鼠飲水量也發(fā)生了變化，如圖4C所示。正常組小鼠的飲水量由造模前的3.8±0.3 mL/d增加到5.21±0.5 mL/d，無(wú)明顯差異。糖尿病組小鼠飲水量由造模前的3.39±0.3 mL/d明顯增加到9.08± 0.5 mL/d (<0.01)，增加了167.85%，增加顯著。并且糖尿病組小鼠的飲水量顯著高于正常組小鼠(<0.01)。造模后小鼠的血糖明顯升高，如圖4D所示。正常組小鼠血糖值一直維持在3.6±0.4 mmol/L，沒(méi)有明顯變化。而造模后，糖尿病組小鼠血糖值為20.1± 6.4 mmol/L，明顯高于造模前小鼠的血糖水平。造模后小鼠攝食、飲水上升，體重下降，并且血糖升高，超過(guò)了11.0 mmol/L，符合2型糖尿病模型的要求，證明2型糖尿病小鼠模型建造成功。

圖4 造模前后小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化

A：體重；B：攝食量；C：飲水量；D：血糖。造模前；造模后。

2.3.2 長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)對(duì)2型糖尿病的療效

小鼠在治療過(guò)程中攝食量的變化如圖5A所示。正常組小鼠飲食基本保持不變，陰性對(duì)照組和非重組酵母治療組小鼠的攝食量有所下降，但下降幅度較小，藥物治療組和重組酵母治療組小鼠的攝食量在治療7 d后呈現(xiàn)明顯的下降，并且在之后的治療中一直維持較低的水平，這說(shuō)明對(duì)于攝食的控制，LHY可以達(dá)到與糖尿病治療對(duì)照藥物相同的效果。

治療過(guò)程中小鼠飲水量的變化如圖5B所示。正常組小鼠飲水基本保持穩(wěn)定，陰性對(duì)照組小鼠的飲水量呈上升趨勢(shì)，非重組酵母治療組小鼠的飲水量無(wú)明顯規(guī)律，但一直保持在較高的水平，超過(guò)了15 mL/d，藥物治療組和重組酵母治療組小鼠的飲水量呈現(xiàn)穩(wěn)中有降的趨勢(shì)，接近正常組小鼠的飲水量。這說(shuō)明LHY可以改善糖尿病小鼠的高飲水量癥狀。

隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠的體重也發(fā)生了變化，如圖5C所示。正常組的小鼠體重隨年齡的增長(zhǎng)有所增加，但是增加不明顯，而陰性對(duì)照組和非重組酵母治療對(duì)照組小鼠體重一直存在下降趨勢(shì)，而陽(yáng)性藥和重組酵母治療組小鼠體重呈上升趨勢(shì)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，這在一定程度上說(shuō)明了本研究構(gòu)建的LHY對(duì)糖尿病有一定的療效，可以阻止糖尿病小鼠體重的減輕。

圖5 治療前后小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化

A：攝食量；B：飲水量；C：體重；D：血糖水平。1：正常組；2：藥物治療組；3：陰性對(duì)照組；4：非重組酵母對(duì)照組；5：重組酵母治療組。

經(jīng)過(guò)16 d的治療后，小鼠血糖的變化如圖5D所示。正常組小鼠的血糖水平基本保持穩(wěn)定，陰性對(duì)照組和非重組酵母治療組小鼠的血糖表現(xiàn)出顯著的上升，而藥物治療組和重組酵母治療組小鼠的血糖比對(duì)照組顯著下降，但未恢復(fù)到正常水平。綜上所述，本研究構(gòu)建的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)對(duì)糖尿病小鼠的體重、攝食、飲水和血糖都有明顯的改善作用。

2.4 重組rolGLP-1對(duì)細(xì)胞活性的影響

本研究使用在大腸桿菌中表達(dá)純化得到的rolGLP-1處理SH-sy5y細(xì)胞，然后通過(guò)MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖6所示?？梢钥吹?，經(jīng)過(guò)不同濃度rolGLP-1處理后的細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照組明顯增多，說(shuō)明rolGLP-1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有良好的細(xì)胞生理活性。

3 討 論

本文成功構(gòu)建了釀酒酵母整合型高效表達(dá)載體pNK1-PGK，并且通過(guò)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)證明其表達(dá)功能正常(圖1，圖2)，隨后使用該載體將GLP-1基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVSC1中，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型和Western blotting成功篩選出了表達(dá)10′GLP-1的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)(圖3)，其生長(zhǎng)迅速，表達(dá)穩(wěn)定(表1)，表達(dá)量達(dá)到了1.56 mg/g細(xì)胞濕重。通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)和高脂高糖飲食聯(lián)合誘導(dǎo)的方法構(gòu)建了2型糖尿病小鼠模型(圖4)，使用長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY)對(duì)其進(jìn)行口服灌胃治療，發(fā)現(xiàn)其具有較好療效，治療后血糖水平明顯降低(圖5)。同時(shí)，利用在生理環(huán)境下，GLP-1通過(guò)與細(xì)胞表面的GLP-1受體(GLP-1R)相互作用，激活胞內(nèi)cAMP-蛋白激酶A信號(hào)通路和PI3K信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的功能，本文使用可以在細(xì)胞表面表達(dá)GLP-1R的SH-sy5y研究重組GLP-1的相關(guān)活性，得到良好結(jié)果(圖6)[14]。

圖6 rolGLP-1對(duì)細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果

A：細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度rolGLP-1處理后MTT檢測(cè)結(jié)果；B：細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度rolGLP-1處理后的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

隨著糖尿病等慢性疾病的流行和快速發(fā)展，人們投入了越來(lái)越多的物力和財(cái)力開(kāi)發(fā)有效治療糖尿病的藥物。GLP-1作為一種新型的生物藥物，與目前使用的一些化學(xué)類藥物相比，其能夠從多個(gè)方面調(diào)節(jié)人體內(nèi)的血糖平衡，對(duì)糖尿病起到一個(gè)綜合的治療作用，并且其能夠抑制胰腺β細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胰腺β細(xì)胞的增殖和分化，恢復(fù)胰腺功能，在“治標(biāo)”的同時(shí)達(dá)到“治本”的效果。

目前，用益生菌活細(xì)胞作為緩釋“膠囊”的新型給藥系統(tǒng)悄然興起，給糖尿病患者帶來(lái)了康復(fù)希望。釀酒酵母是一種食用最為安全的益生菌，其本身富含維生素、消化酶，能調(diào)節(jié)腸胃功能并對(duì)消化酶降解具有一定抵抗作用，從而對(duì)其內(nèi)容物起到緩釋“膠囊”的作用[6]。本研究構(gòu)建的長(zhǎng)效促胰島素降糖酵母(LHY) 采用整合型表達(dá)載體pNK1-PGK將10′GLP-1基因整合到釀酒酵母基因組，使其成為釀酒酵母基因組的一部分，像自身基因一樣穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)效促胰島素(表1)起到降糖作用，并且其本身富含維生素、消化酶，能調(diào)節(jié)腸胃功能。與目前上市的艾塞那肽(Exendin4)、利拉魯肽(Liraglutide)等藥物相比，雖然用藥量較大，但其口服給藥方便，避免了長(zhǎng)期打針注藥的痛苦，無(wú)需分離純化有效成分，易于制備，是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用型較為理想的糖尿病治療藥物。但是，對(duì)其藥物代謝動(dòng)力學(xué)、安全性及人體用藥量等方面尚需進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編委: 呂紅)

Construction of yeast strains expressing long-acting glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and their therapeutic effects on type 2 diabetes mellitus mouse model

Ri Wu1, Chao Ma1, Xiaodan Li1, Huikun Duan1, Yanli Ji1, Yu Wang1, Pingzhe Jiang1, Haisong Wang1, Peipei Tu1, Miao Li1, Ganggang Ni1, Baicheng Ma2, Minggang Li1

Probiotics, i.e., bacteria expressing therapeutic peptides (protein), are used as a new type of orally administrated biologic drugs to treat diseases. To develop yeast strains which could effectively prevent and treat type 2 diabetes mellitus, we firstly constructed the yeast integrating plasmid pNK1-PGK which could successfully express green fluorescent protein (GFP) in. The gene encoding ten tandem repeats of glucagon-like peptide-1() was cloned into the vector pNK1-PGK and the resulting plasmids were then transformed into theINVSc1. The long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast (LHY) which grows rapidly and expresses 10×GLP-1 stably was selected by nutrition screening and Western blotting. The amount of 10×GLP-1 produced by LHY reached 1.56 mg per gram of wet cells. Moreover, the oral administration of LHY significantly reduced blood glucose level in type 2 diabetic mice induced by streptozotocin plus high fat and high sugar diet.

type 2 diabetes mellitus; glucagon-like peptide-1(GLP-1); long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast (LHY); recombinant yeast; mouse model of type 2 diabetes mellitus

2014-06-25;

2014-12-03

天津市科技支撐重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：14ZCZDSY00013)資助

吳日，教育部公派訪問(wèn)學(xué)者，金日成綜合大學(xué)平壤醫(yī)學(xué)院副教授。E-mail: tj20110901@163.com馬超，碩士研究生，專業(yè)方向：生物技術(shù)與新藥。E-mail: mac1002@outlook.com吳日和馬超并列第一作者。

李明剛，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物技術(shù)與新藥。E-mail: mgl@nankai.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-206

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2014-12-30 9:41:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141230.0941.001.html