呂江（河北省張家口市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 075000）丁勇（河北省懷安動物疫病預(yù)防控制中心 076150）

自擬治療弓形蟲病中藥復(fù)方的篩選試驗

呂江（河北省張家口市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 075000）丁勇（河北省懷安動物疫病預(yù)防控制中心 076150）

研究以尋求高效、安全治療弓形蟲病的復(fù)方中藥為目的，用自擬治療弓形蟲病的方劑對人工感染的小白鼠進(jìn)行復(fù)方中藥的篩選試驗。結(jié)果表明，篩選出的復(fù)方中藥是低毒、安全、療效確切的抗弓形蟲病藥物，為臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)。

中藥方劑；弓形蟲；篩選試驗；安全性試驗

弓形蟲病是剛第弓形蟲引起的一種人和多種動物共患寄生蟲病。這一病原體于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的嚙齒類梳趾鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并正式命名?，F(xiàn)在豬弓形蟲病多以隱性感染、繼發(fā)和并發(fā)感染等形式存在于一些豬場。不少病例報告以及血清學(xué)調(diào)查結(jié)果證明，豬弓形蟲病仍然是養(yǎng)豬生產(chǎn)以及公共衛(wèi)生的一大隱患[1]。因此，本病給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來很大危害和威脅。鑒于原有常用治療藥物，包括磺胺類、乙胺嘧啶、螺旋霉素及氯化林可霉素等，單或聯(lián)用，均存在療程長，毒副反應(yīng)較多，療效尚不理想、且不能根治等問題，迫切需要探索新的治療方法和尋找抗弓形蟲藥[2]。針對存在問題，我們進(jìn)行本試驗，為尋求一種簡便、高效治療弓形蟲病的中藥方劑提供一定的理論根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

小白鼠為河北北方學(xué)院物資科動物室繁殖的昆明種，體重為18～25g的健康小白鼠，雌雄各半。

試驗藥物：方劑一：黃芪、白術(shù)、青蒿、草果、檳榔。方劑二：黃芩、甘草、檳榔、黃芪。所有中藥均購自張家口市南山堂大藥房。

1.2 試驗方法

1.2.1 弓形蟲速殖子懸液的制備

將本室保種的RH株弓形蟲速殖子常規(guī)腹腔接種小鼠數(shù)只，72h后斷頸處死，收集腹水，用生理鹽水洗滌并稀釋，暗視野下計數(shù)，調(diào)整蟲數(shù)濃度至5×104/ml，試驗時每只小鼠腹腔注射0.2ml。

1.2.2 復(fù)方中藥的制備

復(fù)方中藥水煎液的制備：將配好的復(fù)方中藥置砂鍋內(nèi)，加入6～8倍的冷水浸泡30～60min，用火加熱，開始用強(qiáng)火，沸后改用文火，煮沸30min，用紗布過濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)按上法煎煮，沸后煎煮30min，濾過，合并得兩次濾液，于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原藥材1g的藥液，即配成100%的水煎劑，經(jīng)高壓滅菌20min，冷卻后置冰箱中備用。試驗前按需要稀釋。

復(fù)方中藥醇提液的制備：取原藥100g，加95%乙醇200ml浸泡24h，傾取上層液過濾于蒸發(fā)皿內(nèi)，殘留再加100ml乙醇提取二次，合并提取液濾液，自然干燥得提取物。提取率為9.12%。臨用前按需要進(jìn)行稀釋。

1.2.3 試驗動物分組

篩選試驗60只感染弓形蟲的小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，第1組為弓形蟲陽性對照組（A組）；第2組為方劑一治療組（B組），第3組為方劑二治療組（C組），感染弓形蟲4h后灌胃，每次0.5ml，連續(xù)14天給藥，每天1次；另取20只未感染小鼠每天灌胃0.5ml生理鹽水作為對照組（D 組）。

急性毒性試驗：取健康小白鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組5只，分別采用水煎劑灌胃和腹腔注射醇提液兩種給藥途徑，按每kg體重5g、10g和15g三個劑量，使用時加適當(dāng)?shù)乃姑恐恍“资蠊辔噶吭?.5ml。

亞慢性毒性試驗：取健康小白鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，每組10只，第1組為對照組，第2組和第3組分別將復(fù)方中藥按10%和20%比例混入小白鼠飼料中，然后做成塊狀飼料喂給小白鼠。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥的篩選試驗結(jié)果

2.1.1 自擬方劑對正常小鼠影響

生理鹽水對照組小鼠在給藥期間未出現(xiàn)異常反應(yīng)，小鼠死亡時間與正常小鼠死亡時間差別無顯著性（P＞0.05），表明自擬方劑對小鼠無明顯毒害作用。

2.1.2 自擬方劑對感染小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的影響

在感染弓形蟲24h和72h分別從各組隨機(jī)取5只小鼠解剖，其中常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲速殖子的小白鼠72h后大腸嚴(yán)重便秘，腹水明顯增多，取腹水計數(shù)蟲體。結(jié)果見圖1，2，表1。生理鹽水對照組小鼠于存活1月后解剖，取腹水鏡檢，未見蟲體。

圖1 常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲速殖子的小白鼠72h后大腸便秘

圖2 常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲速殖子的小白鼠72h后腹水明顯增多

表1 感染弓形蟲24h和72h小白鼠腹水中蟲數(shù)（個/ml）

2.1.3 各試驗組小白鼠平均存活天數(shù)的比較

陽性對照組小白鼠平均存活5.6d，方劑二治療組小白鼠平均存活12.8d，生理鹽水對照組小鼠在第21天時死亡1只。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與陽性對照組小白鼠生存時間相比，方劑二治療組小白鼠生存時間有顯著性延長（P＜0.01）。詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.2 復(fù)方中藥的安全性試驗結(jié)果

2.2.1 急性毒性試驗

用藥后每天觀察小白鼠的狀況，連續(xù)7天，各組小白鼠均無死亡，未出現(xiàn)中毒癥狀。在此基礎(chǔ)上，另取20只小白鼠分成兩組，按kg體重20g劑量采用上述兩種途徑給藥，24h內(nèi)未見死亡，72h后又重復(fù)給藥一次，并連續(xù)觀察7天，小白鼠無死亡，且健康活潑，食欲良好。結(jié)果表明該復(fù)方中藥LD50＞20g/kg，按急性毒性分級屬無毒物。

2.2.2 亞慢性毒性試驗結(jié)果

在90天試驗期內(nèi)觀察，各組小白鼠飲食、糞便、體態(tài)、運動、聲、光反射均未見異常，無死亡。血常規(guī)各項指標(biāo)、肝體比和腎體均屬正常（表3、表4）。采血致死后尸體剖檢，各組小白鼠心、肝、脾、肺和腎的大小、顏色、質(zhì)地均未見異常。

3 結(jié)論與討論

自擬方劑陰性對照組小鼠在用藥期間無任何不良反應(yīng)，且其生存時間與正常小鼠生存時間一致，表明自擬方劑本身毒性較小，與文獻(xiàn)報道的乙胺嘧啶的毒副作用（肝腎功能的損害，骨髓抑制、過敏、致畸及消化道不適等不良反應(yīng)）則有明顯的差異[3]。因此自擬方劑是低毒可靠的藥物。

表2 試驗組與陽性對照組小白鼠平均存活天數(shù)的比較

表3 血常規(guī)檢查結(jié)果

表4 肝體比、腎體比測定結(jié)果

試驗觀察了感染弓形蟲后不同時間（24h、72h和死亡后）各試驗組與陽性對照組小鼠腹水中蟲體數(shù)量的變化，結(jié)果表明自擬方劑經(jīng)口灌服能明顯減少感染小鼠腹水中蟲體數(shù)量，表明自擬方劑能明顯抑制弓形蟲的繁殖。同時從表1可見方劑二對感染小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的影響更顯著（P＜0.01），通過進(jìn)一步觀察小鼠存活天數(shù)，方劑二能有效延長小鼠存活時間，治療效果更明顯，方劑組成更合理。該方劑中黃芪補(bǔ)氣，檳榔殺蟲，黃芩抗菌、解毒，甘草調(diào)和諸藥，顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，從而提高了藥物的使用效率[4,5]。

弓形蟲Rh株屬于強(qiáng)毒株，小白鼠感染1個滋養(yǎng)體后即可引起死亡。感染10個滋養(yǎng)體7～8d內(nèi)死亡率達(dá)100%。Grimwood（1980）腹腔接種小白鼠后，小白鼠平均存活5d[6]。曾艷波等報道，小鼠感染弓形蟲后，死亡時間通常在5.5～7d[7]。于恩庶報道試驗小鼠3d內(nèi)全部死亡。本試驗方劑二治療組平均存活時間為12.8d，是對照組存活時間（5.6d）的2倍多，按照徐淑云[8]療效判定標(biāo)準(zhǔn)判定方劑二治療弓形蟲病有效。

復(fù)方中藥對小鼠進(jìn)行的急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗，采用水煎劑醇提液兩種給藥途徑，按kg體重5g、10g和15g三個劑量以及在90天試驗期內(nèi)的觀察。結(jié)果表明，用藥后各組小白鼠均無死亡，未出現(xiàn)中毒癥狀。血常規(guī)檢查、肝體比、腎體比、尸體剖檢、病理組織切片檢查均無異常。說明該復(fù)方藥物在適宜劑量時屬無毒物。本試驗對小鼠進(jìn)行的急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗觀察，采用兩種給藥途徑，三個劑量證明該方劑在適宜劑量時安全可靠的。

綜上所述，自擬復(fù)方中藥是低毒，療效確切的抗弓形蟲藥物，為臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)。

[1]李祥瑞.弓形蟲病的流行的新趨勢[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（S1）：234-236.

[2]王明建，鞠玉林，高威，等.4種中藥治療急性弓形蟲感染小鼠的療效觀察[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：32-33.

[3]司開衛(wèi),李哲,程彥斌.扁桃酸治療小鼠急性弓形蟲病的效果[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2001，19（1）:59-60.

[4]蔣蔚，陳永軍，張花景，等.磺胺氯吡嗪鈉中藥復(fù)方對小鼠體內(nèi)抗弓形蟲療效的觀察[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44（12）：2022-2028.

[5]萬紅嬌，楊翠萍，蔡長春，等.自擬抗弓形蟲湯對小鼠急性弓形蟲感染的治療機(jī)制研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（9）：1551-1553.

[6]于恩庶.弓形蟲病學(xué) [M].福建：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1992:45,240.

[7]曾艷波，朱順海，韓紅玉，等.不同保種時間及復(fù)蘇代次弓形蟲對小鼠致病性研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（6）：55-59.

[8]徐淑云.藥物試驗方法學(xué)習(xí)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995:13-20.

河北省教育廳自然基金項目（2007103）。

丁勇（1970.3-），男，畜牧獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)臨床、實驗室化驗、疾病預(yù)警、動物疫病防控技術(shù)、生物制品研究與推廣工作。