付文婷++張愛民++廖芳芳++韓世玉++何建文++楊紅

摘要 采用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉和冰水3種試劑對辣椒辛香8號花藥培養(yǎng)再生植株根尖進行預處理，研究不同預處理對根尖細胞中期分裂相的影響效果，并對辣椒花藥培養(yǎng)再生植株進行倍性鑒定，以期獲得辣椒染色體計數(shù)的最佳預處理。結果表明：3種預處理中，利用0.1%秋水仙素對辣椒根尖預處理3 h，細胞的中期分裂指數(shù)最高，達56.6‰，而且染色體分散度好，染色體分裂相多，比較適合染色體計數(shù)；經染色體計數(shù)鑒定得出5株花藥培養(yǎng)再生植株中有4株雙倍體和1株單倍體，可用于下一步育種實踐中。

關鍵詞 辣椒；根尖；預處理；倍性鑒定

中圖分類號 S641.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）18-0077-02

Pretreatment for Pepper Root Tip and Plant Ploidy Identification

FU Wen-Ting ZHANG Ai-min LIAO Fang-fang HAN Shi-yu HE Jian-wen YANG Hong

（Pepper Institute of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550006）

Abstract Pepper Xiangxin8 root tip were pretreated with three reagents including 0.1% colchicine，0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline and ice water to study the effect of different pretreatment on root tip cells in metaphase of pepper，and the ploidy was identified of another culture derived pepper plants to obtain well pretreatment for chromosome counting. The results showed that metaphase mitotic index was as high as 56.6‰ in the density of 0.1% colchicines and 3 hours treatment，which the chromosomes spreader well，more split phases，and were suitable for counting. 4 haploid and 1 diploid were identified in 5 regenerated plants by chromosome counting. These could be used for breeding.

Key words pepper；root tip；pretreatment；ploidy identification

辣椒屬茄科辣椒屬，原產地中南美洲，自17世紀40年代從中南美洲傳入我國，育種工作者對其不斷改進改良[1]，尤其可以通過花藥培養(yǎng)快速獲得有價值的純系用于培育新品種。但通過花藥培養(yǎng)得到的再生植株，往往都是單倍體、雙單倍體及其他倍性復雜的混合群體，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎。因此，通過染色體根尖壓片技術進行細胞倍性鑒定是最直接和最可靠的方法，計數(shù)準確，不需要復雜的儀器，是目前應用廣泛的鑒定方法[2-3]。染色體壓片計數(shù)，計數(shù)的最佳時期是有絲分裂中期的染色體。但是，在有絲分裂周期中，分裂中期的持續(xù)時間很短，只有10～30 min。因此，中期分裂相所占比例很小。此外，由于分裂中期的染色體緊密排列在赤道面上，又有紡錘絲的牽制，所以，在制片中往往很難將其分散開。尤其是染色體比較大或數(shù)量較多時，很容易產生染色體的嚴重重疊，不僅不能識別單條染色體形態(tài)，而且連計數(shù)也困難[4]。為了克服上述困難，在染色體制片時，一般需要用化學或物理方法對材料進行預處理。在具體實踐中，由于取材不當而導致制片失敗經常發(fā)生[5]。而辣椒的染色體小，且數(shù)目較多，因此要通過常規(guī)的壓片程序很難得到分散度高和分類相多的制片，近年來，有關辣椒辣椒染色體制片的報道也比較少[6-8]，在辣椒染色體制片一般以辣椒根尖為試材，其取材方便，是觀察細胞分裂的良好材料[9]。在取材適宜的條件下，染色體制片成功與否最關鍵的步驟便是材料的預處理。本研究采用秋水仙素、8-羥基喹啉和冰水對辣椒根尖染色體進行預處理，為辣椒花藥培養(yǎng)再生植株的鑒定和根尖染色體觀察找到適宜的預處理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為辣椒辛香8號花藥培養(yǎng)再生植株，由貴州省辣椒研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒根尖染色體制片法。具體包括：①根尖培養(yǎng)。通過花藥培養(yǎng)的辛香8號再生植株，方法參照付文婷等[10-11]研究。將再生植株放入生根培養(yǎng)基MS+0.01 mg/L NAA（蔗糖25 mg/L+瓊脂7 mg/L，pH值5.8）中，放置到光照強度為2 000 lx，光照時間為16 h/d，溫度為25 ℃下發(fā)芽并培養(yǎng)根系發(fā)達的壯苗。待組培苗根達1 cm時于8：00—10：00取細胞分裂旺盛期的根尖進行預處理。②根尖預處理。分別用濃度0.1%秋水仙素和0.002 mol/L的8-羥基喹啉分別對根尖浸泡處理3～4 h；冰水處理24 h，雖然處理時間長，但對處理材料不會產生藥害，可有效將有絲分裂停留在中期[12]。③固定。將經過預處理的根尖先用蒸餾水沖洗3～5次，再放到卡諾固定液（3份無水乙醇∶1份冰醋酸）中固定24 h。固定后可用95%乙醇浸泡20 min，后轉入85%乙醇浸泡20 min，然后轉入70%乙醇中在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。④解離和染色。從固定液中取出根尖，用蒸餾水漂洗3～5次，再放到0.1 mol/L HCl中，在65 ℃水浴中解離5～8 min。將解離好的根尖用水沖洗后將根尖放到卡寶品紅染色劑中染色。⑤壓片和鏡檢。取1根染色后的根尖置于載玻片上，取根尖近0.05 cm處的根尖，滴少量的染色劑，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭端輕輕敲打蓋玻片，用吸水紙將多余滲出的染色液吸干。將壓好的片子置于奧林巴斯（IX71）60×物鏡下觀察并照相。endprint

1.2.2 辣椒花藥培養(yǎng)再生苗倍性鑒定。剪取再生苗的根尖進行染色體壓片，采用染色體計數(shù)法，確定再生苗的倍性水平。

1.2.3 觀察與統(tǒng)計。每個處理樣品取3個根尖壓片觀察，記錄每個片子3個視野內觀察到的總細胞數(shù)、分裂的細胞數(shù)和中期分裂細胞數(shù)。有絲分裂指數(shù)是指處于有絲分裂期的細胞數(shù)與被觀察的細胞總數(shù)之比，用千分率表示，以此來測定根尖細胞的有絲分裂活性。中期分裂相指數(shù)指處于分裂中期細胞數(shù)與被觀察的細胞總數(shù)之比。用千分數(shù)表示，以此測定根尖細胞的經預處理后處于中期細胞數(shù)的比例[13]。

2 結果與分析

2.1 不同預處理對辣椒中期分裂相的影響

用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉和冰水處理分別處理辣椒根尖細胞對有絲分裂產生的影響不同。由表1可知，用0.1%秋水仙素處理3 h時根尖細胞的中期分裂指數(shù)最高，達56.6‰，其次是0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理3 h時，中期分裂指數(shù)是30.6‰，而冰水處理24 h根尖細胞的中期分裂指數(shù)最低，只有15.7‰。說明用0.1%秋水仙素處理辣椒根尖時效果最佳。

2.2 不同預處理對辣椒根尖細胞倍性鑒定的影響

用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理3 h和冰水處理辣椒根尖24 h。由圖1可知，3種預處理的試劑均能將根尖細胞的有絲分裂停留在中期，但冰水處理的染色體分裂相少，分散度差，粘連嚴重，染色體較短，不利于染色體計數(shù)（圖1c）。0.1%秋水仙素處理的染色體分散度好，染色體分裂相多，比較適合染色體計數(shù)（圖1a）；經0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理的染色體分裂相（圖1b）居于0.1%秋水仙素和冰水之間，但其染色體分散度不理想，易粘連，染色體數(shù)很難區(qū)分。

2.3 辛香8號辣椒花培再生植株根尖染色體倍性鑒定結果分析

在前期研究的基礎上，對獲得的5株辛香8號花藥培養(yǎng)再生植株進行倍性鑒定。將其根尖經0.1%秋水仙素進行3 h預處理，再進行固定、染色、壓片和觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），5株再生植株中，4株為二倍體，n=24（圖2a），只有1株為單倍體n=12（圖2b），為正常倍性辣椒細胞染色體數(shù)目的1/2。

3 結論與討論

在根尖染色體壓片技術中，在有絲分裂中能否把細胞停留在中期，預處理起到至關重要的作用[14]，預處理不僅使中期分裂相的細胞增加，還能有利于分散，便于染色體的計數(shù)。本試驗利用3種不同的預處理試劑對辣椒根尖進行處理，結果發(fā)現(xiàn)不同的試劑對辣椒根尖的中期分裂指數(shù)影響不同，0.1%秋水仙素處理的根尖細胞的中期分裂指數(shù)最高，且染色體不會發(fā)生斷裂、丟失現(xiàn)象。這與賽爾蘭·熱合買提等[15]研究一致。而江力榕等認為冰水預處理24 h使辣椒根尖可以獲得數(shù)目較多，分散均勻的辣椒根尖細胞染色體早中期分裂相[16]，這與本試驗結果不一致?？赡芘c預處理的溫度、時間和試劑多種因素的影響有關。但在預處理根尖材料試驗中，一定要掌握好根尖細胞的分類高峰的時間段，這樣才能獲得更多的分散良好的中期細胞。

在花藥培養(yǎng)中，早期及時有效的倍性鑒定是構建DH群體十分關鍵的技術環(huán)節(jié)，也關系到單倍體的育種進程[17]。利用染色體壓片計數(shù)法對辣椒進行倍性鑒定是最直接、可靠的方法。研究發(fā)現(xiàn)利用0.1%秋水仙素處理3 h對染色體計數(shù)效果最佳，分散度好且不粘連，便于染色體計數(shù)來鑒定植株倍性水平。

4 參考文獻

[1] 鄒學校.中國辣椒[M].北京：中國農業(yè)出版社，2002：1-2.

[2] 楊起簡，周禾，孫彥，等. 豌豆染色體制片技術的比較研究[J].北京農學院學報，2003，13（3）：201-203.

[3] 李鵠鳴，張曉蓉，王菊鳳.我國薯蕷屬植物基礎研究進展[J].經濟林研究，1999，17（2）：43-48.

[4] 李懋學，張敩方.植物染色體研究技術[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學出版社，1991：164-171.

[5] 李懋學，張贊平.作物染色體及其研究技術[M].北京：中國農業(yè)出版社，1996：17-20，25-28.

[6] 祝海燕，羅雙霞，陳雪平，等.幾種茄科蔬菜的核型分析和比較[J].河北農業(yè)大學學報，2013，36（6）：21-24.

[7] 蔡華，何佩山.兩種不同基因型辣椒的核型比較[J].江蘇農業(yè)學報，（下轉第82頁）

（上接第78頁）

2009，25（5）：1108-1111.

[8] 賈彩紅，王家保，徐碧玉，等.2個辣椒栽培種的核型分析[J].熱帶作物學報，2008，29（4）：485-488.

[9] 付文婷，何建文，楊紅，等.辣椒花藥培養(yǎng)再生植株的倍性鑒定[J].貴州農業(yè)科學，2015，43（6）：18-21.

[10] 付文婷，韓世玉，邢丹，等.不同培養(yǎng)基及采花期對辣椒花藥培養(yǎng)的影響[J].河南農業(yè)科學，2014，43（10）：83-86，94.

[11] 付文婷，廖芳芳，何建文，等.不同溫度和外源添加物對辣椒花藥的培養(yǎng)效果[J].南方農業(yè)學報，2015，46（4）：635-640.

[12] 張菊平，劉珂珂，鞏振輝，等.辣椒染色液常規(guī)鏡檢技術[J].生物學通報，2006，41（10）：50-51.

[13] 童一中.作物育種常用的統(tǒng)計分析法[M].上海：上?？茖W技術出版社，1979：98-100.

[14] 李愛華，魯坤存.實驗室常用預處理因素的比較研究[J].實驗室研究與探索，2002，21（5）：94-96.

[15] 賽爾蘭·熱合買提，薩娜瓦爾·艾比布拉，陳全家，等.不同預處理對鷹嘴豆根尖細胞染色體制片的影響[J].生物學通報，2014，49（4）：47-49.

[16] 江力榕，陳沁，劉文軒.預處理對辣椒根尖細胞染色體制片的影響[J].上海大學學報（自然科學版），2005，11（4）：427-430.

[17] 介智靖，閆曉紅，方小平，等.甘藍型油菜DH 植株創(chuàng)建及其倍性的流式鑒定[J].中國油料作物學報，2010，32（3）：349-353.endprint