王 波，閆 衡，王肅軍，劉阿靜，楊盛鑫，周 圍，，*

(1．甘肅出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000;2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;3．西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

手性是自然界普遍存在的現(xiàn)象，隨著科學(xué)的發(fā)展，對光學(xué)純物質(zhì)的需求量越來越大，手性對映體分離日益引起人們的關(guān)注。近年來手性香精香料的研究與開發(fā)已成為世界各大香精香料公司主要開發(fā)的方向和焦點之一［1］。因此研究手性化合物的分離對于手性香精香料的開發(fā)具有非常重要的意義。

芳樟醇(Linalool)又名沉香醇、芫荽醇、里那醇等，學(xué)名為3，7-二甲基-1.6-辛二烯-3-醇，分子式為C10H18O，分子量154.24，屬于鏈狀萜烯類，具有鈴蘭香氣，幾乎不溶于水和甘油，溶于丙二醇、非揮發(fā)性油和礦物油，混溶于乙醇和乙醚，具有左旋和右旋兩種光學(xué)異構(gòu)體。在不同來源的精油中，多為異構(gòu)體混合物，消旋體存在于香紫蘇油、茉莉油和合成芳樟醇中，右旋體存在于芫荽油、某些品種的香紫蘇油中，左旋體存在于芳樟葉油、黃樟油、熏衣草油、玫瑰木油中。當(dāng)今“芳香療法”和“芳香養(yǎng)生”廣泛使用的各種精油中，芳樟葉油被公認(rèn)為具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜、抗菌、止痛、松弛肌肉等作用。已有研究表明，左旋體的鎮(zhèn)靜作用明顯，而右旋體則相反，故對芳樟醇進(jìn)行手性拆分而得到光學(xué)純物質(zhì)具有重要意義［2－3］。

目前，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)和超臨界流體色譜(SFC)等方法在手性化合物分離領(lǐng)域均發(fā)揮著重要作用。其中，HPLC有大量的手性固定相(CSPs)可供選擇，是最通用的色譜分離技術(shù)。超高效合相色譜法(Ultra performance convergence chromatography，UPC2)除了具有傳統(tǒng)超高效液相色譜的優(yōu)點外，還可與超臨界流體色譜技術(shù)結(jié)合，以超臨界流體CO2為流動相主體，依靠流動相的溶劑化能力進(jìn)行分離分析［4－6］。UPC2能夠通過精確調(diào)節(jié)流動相強度、壓力和溫度，獲得所需的系統(tǒng)分辨率和選擇性，可對待測物的保留和分離進(jìn)行有效調(diào)控，與常規(guī)的HPLC，GC和SFC技術(shù)相比，具有體系重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好、分離效率高等特點，有效彌補了HPLC，GC和SFC在分離手性物質(zhì)方面的不足。近年來，采用HPLC，SFC技術(shù)分離手性化合物的研究已有較多報道［7－16］，對于芳樟醇的拆分也有不少報道［17－21］，但UPC2技術(shù)應(yīng)用于芳樟醇對映體分離尚未見報道。本研究將UPC2技術(shù)應(yīng)用于芳樟醇對映體的拆分，分離過程中有機溶劑的用量極少，是一種快速、簡單、環(huán)保、高效的分離方法。該研究為芳樟醇手性化合物的分離開拓了一種新途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效合相色譜儀(美國Waters公司)，配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);MS3渦旋儀(德國IKA公司);CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色譜柱(150 mm×3.0 mm，4.6 μm，日本資生堂);移液槍(美國 Thermo Electron 公司，100～1 000 μL，20～100 μL)。

工業(yè)芳樟醇(純度90%，上海申寶香精香料有限公司);CO2(純度99.997%，蘭州匯能公司)，甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精確稱取芳樟醇100 μL，用正己烷溶解并定容至100 mL，配成0.1%的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃下冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移1 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用正己烷定容至10 mL，稀釋為0.01%的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下冷藏待用。

1.3 超高效合相色譜條件

色譜柱:CAPCELL PAK Chiral CD－Ph(150 mm×3.0 mm，4.6 μm);流動相:A為CO2，B為乙腈;流速1.2 mL/min;進(jìn)樣量3 μL;柱溫30℃;檢測波長215 nm;動態(tài)背壓(ABPR):1 700 psi。等度洗脫:CO2與乙腈的體積比為97∶3。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性劑對分離的影響

由于在超高效合相色譜中，流速對手性化合物的分離基本無影響［22］，故實驗流速設(shè)為1.2 mL/min。在β-環(huán)糊精鍵合固定相的手性分離中，選擇不同的有機改性劑，可以改變對映體分離的選擇性。UPC2中有機改性劑通常為甲醇或乙腈。在其它色譜條件不變的情況下，考察流動相分別選擇甲醇或乙腈為有機改性劑時對芳樟醇手性分離的影響。結(jié)果顯示，以甲醇作為有機改性劑時，由于甲醇具有較大的極性，芳樟醇不能得到分離。而乙腈作為有機改性劑時，芳樟醇對映體可得到較好的分離，且峰形尖銳。因此實驗選擇乙腈作為有機改性劑。

2.2 動態(tài)背壓(ABPR)對分離的影響

超高效合相色譜中，動態(tài)背壓(ABPR)也是影響分離過程的重要因素之一，其主要作用是控制CO2在整個操作過程中處于超臨界流體狀態(tài)。在不同的動態(tài)背壓下，CO2超臨界流體對樣品有著不同的溶解能力。當(dāng)背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強。實驗考察了背壓在1 500～2 000 psi范圍內(nèi)時對樣品分離度的影響(見表1)。

表1 動態(tài)背壓對芳樟醇對映體分離的影響Table 1 Effect of active back pressure(ABPR)on separation parameters of linalool

結(jié)果顯示，當(dāng)ABPR為1 650 psi時，分離度最大達(dá)1.02，隨著背壓升高至2 000 psi，芳樟醇對映體的分離度逐漸減小。這是由于隨著動態(tài)背壓的升高，CO2超臨界流體的密度、黏度隨之增加，柱壓升高，溶劑化能力改變所致。而1 650 psi時，CO2超臨界流體的密度、溶劑化能力最適合芳樟醇對映體的分離。綜合考慮保留時間、峰形及色譜柱壓力，實驗選擇動態(tài)背壓為1 700 psi。

2.3 溫度對分離的影響

柱溫是影響色譜分離對映體過程的重要因素，柱溫的變化不僅影響對映體在固定相上吸附－解離的速度，還會影響對映選擇性，甚至可能導(dǎo)致固定相構(gòu)型發(fā)生變化，從而影響溶質(zhì)與手性固定相間的相互作用，使光學(xué)異構(gòu)體的洗脫次序出現(xiàn)反轉(zhuǎn)。柱溫對分離的影響主要有:①隨著柱溫的升高，超臨界流體的密度降低，樣品分子的保留增強，容量因子增加;②隨著柱溫的升高，樣品分子的傳質(zhì)速率增加，有助于從固定相表面脫附進(jìn)入流動相中，容量因子減?。?3］。本實驗在保持其它色譜條件不變的前提下，考察了柱溫在30～55℃范圍內(nèi)變化時對目標(biāo)物分離的影響(見表2)。從表2可知，芳樟醇對映體的容量因子(k')、分離度(Rs)和選擇因子(α)隨著柱溫升高而逐漸減小，即保留時間縮短，分離效果降低，這說明芳樟醇對映體的分離主要受第二方面的影響。因此，本實驗選擇最佳柱溫為30℃。

表2 溫度對芳樟醇對映體分離的影響Table 2 Effect of temperature on linalool separation parameters

2.4 進(jìn)樣量對分離的影響

與傳統(tǒng)的超高效液相色譜流動相不同，UPC2主要以CO2超臨界流體為流動相，進(jìn)樣量的改變會明顯影響CO2超臨界流體的溶劑化能力，進(jìn)而影響色譜峰形及目標(biāo)物之間的分離度。當(dāng)芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時，考察了進(jìn)樣量分別為1，3，5，8，10 μL時的分離效果，結(jié)果表明，芳樟醇對映體的分離度隨著進(jìn)樣量的增加而減小，且峰形逐漸不對稱，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時，芳樟醇對映體已無法完成分離。故本實驗在芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時，選擇最佳進(jìn)樣量為3 μL。最終確定分離條件為:紫外檢測波長215 nm，改性劑為乙腈，流動相流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，動態(tài)背壓1 700 psi，芳樟醇體積分?jǐn)?shù)為0.01%時，最佳進(jìn)樣量3 μL;在上述優(yōu)化條件下，芳樟醇對映體的保留時間分別為1.33 min和1.46 min，總運行時間3 min，圖1為芳樟醇對映體的拆分色譜圖。

圖1 芳樟醇對映體的拆分色譜圖Fig.1 Chromatogram of linalool separation

2.5 對映體分離過程中的熱力學(xué)參數(shù)

由色譜圖及分離參數(shù)可以看出，在對芳樟醇對映體分離的過程中，色譜柱柱溫對分離效果有很大影響，對UPC2法分離檢測芳樟醇對映體在色譜柱上分離的熱力學(xué)研究可進(jìn)一步搜索芳樟醇對映體在色譜柱上的分離保留機理，有助于建立及優(yōu)化對映體的分離檢測條件，并對芳樟醇對映體的進(jìn)一步研究有著重要意義。利用色譜法分離光學(xué)異構(gòu)體的過程中，溶質(zhì)的容量因子(k')與柱溫的關(guān)系以及對映體分離因子(α)與柱溫的相關(guān)性可用Gibbs－Holmholtz方程(公式1)和Van't Hoff方程(公式2)［24］獲得:

式中，k'為溶質(zhì)的容量因子，ΔH和ΔS分別為保留過程中溶質(zhì)的焓變和熵變，R為氣體常數(shù)，T為柱溫(K)，φ為相比，Δ(ΔH)和Δ(ΔS)分別為光學(xué)異構(gòu)體間的焓變和熵變的差值。以lnk'或lnα為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得到Vant't Hoff曲線。芳樟醇對映體lnk'和lnα與1/T的相關(guān)性見表3。

表3 芳樟醇對映體lnk和lnα與1/T的相關(guān)性Table 3 Relationship between lnk and lnα of linalool and 1/T

由表3可以看出，芳樟醇對映體的lnk'和lnα與1/T之間具有較好的線性關(guān)系，這說明在30～55℃范圍內(nèi)柱溫的變化對芳樟醇對映體在Chiral CD－Ph手性色譜柱保留機理影響較小。ΔH衡量溶質(zhì)在固定相上吸附過程的放熱情況，反映溶質(zhì)與固定相的作用力大小。ΔH值越負(fù)，說明溶質(zhì)與固定相的作用越強，與固定相的結(jié)合在能量上更有利。ΔS表示溶質(zhì)吸附過程自由度的變化情況，ΔS越負(fù)說明自由度降低越多，分子總體變得更有序。Δ(ΔH)表示兩對映體與固定相的作用強度之差，Δ(ΔS)表示自由度變化之差。若Δ(ΔH)和Δ(ΔS)均為負(fù)值，說明手性拆分為焓驅(qū)動，后出峰異構(gòu)體較前出峰異構(gòu)體與固定相存在較強的相互作用，溫度升高分離因子下降。若兩者皆為正值，說明手性拆分為熵驅(qū)動，分離因子和柱效均隨柱溫的升高而升高。若Δ(ΔH)為負(fù)而Δ(ΔS)為正，說明兩者對手性識別均有貢獻(xiàn)［25－27］。

根據(jù)Vant't Hoff曲線可以求出芳樟醇對映體在CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色譜柱保留過程中的焓變(ΔH)、焓變差(－Δ(ΔH))、熵變差(－Δ(ΔS))等熱力學(xué)參數(shù)。其中，焓變 ΔH分別為－5 844.08，－8 109.06 J/mol，焓變值均為負(fù)，說明芳樟醇與β-環(huán)糊精固定相之間的作用較強，屬于放熱過程。而－Δ(ΔH)為負(fù)值(－2 370.24 J/mol)，－Δ(ΔS)為正值(6.60 J/mol)，這說明芳樟醇對映體拆分過程中，既存在熵驅(qū)動也存在焓驅(qū)動，并以焓驅(qū)動為主。

3 結(jié)論

本文采用超高效合相色譜對芳樟醇對映體進(jìn)行分離，考察了有機改性劑、柱溫、動態(tài)背壓和進(jìn)樣量的影響，最終確定分離條件為:紫外檢測波長215 nm，改性劑為乙腈，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，動態(tài)背壓1 700 psi，芳樟醇濃度為0.01%時，最佳進(jìn)樣量3 μL。最佳實驗條件下的運行時間僅為3 min，能夠?qū)崿F(xiàn)對芳樟醇對映體的基線分離。并對超高效合相色譜分離芳樟醇對映體的熱力學(xué)進(jìn)行初步分析，為此類化合物的分離與分析提供了理論基礎(chǔ)。

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