孟慶芳 ，馬志強，陳知航，李麗，劉運龍，單成啟，錢小紅，程遠國

1.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所，國家蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

CD20是B淋巴細胞表面特異性抗原之一，在淋巴細胞分化早期表達并且能激活淋巴細胞，導(dǎo)致淋巴細胞增殖分化。CD20 分子在95%以上的B 細胞性非霍奇金淋巴瘤（NHL）中均有表達，是治療B 細胞淋巴瘤的理想靶點[1]。人鼠嵌合抗CD20抗體由鼠抗CD20抗體可變區(qū)肽段和人抗體IgG1恒定區(qū)肽段組成，臨床實驗證明治療效果明顯且副反應(yīng)小，已經(jīng)被美國FDA批準投入市場，商品名為Rituximab[2]。

本研究選擇實驗室構(gòu)建并表達的重組抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體TSLXK 進行。這種嵌合抗體雖然通過人源化改造，減少了鼠源組分，但給藥后仍然存在一定程度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗藥物抗體（antidrug antibody，ADA）產(chǎn)生，尤其是在臨床前動物實驗中，由于種屬差異，抗體更易產(chǎn)生。在治療性蛋白質(zhì)藥物臨床應(yīng)用過程中，應(yīng)對免疫原性給予關(guān)注，多家國際權(quán)威機構(gòu)就蛋白質(zhì)藥物免疫原性的評價發(fā)布了指導(dǎo)原則[3-5]。美國FDA 建議采用多重檢測法評價抗體藥物的免疫原性，建立一種靈敏度高、操作簡單快捷、通量高的篩選法，對臨床樣品進行初步篩選，篩選呈陽性結(jié)果的樣品還須進一步采用確證法確定檢測抗體特異性結(jié)合藥物抗體[6-7]。目前，抗體藥物免疫原性檢測方法很多，如橋連ELISA法、間接ELISA 法、放射免疫沉淀法（RIP）、表面等離子共振法（SPR）等，各種方法都具有其優(yōu)缺點。

為評價TSLXK 的免疫原性，我們建立了橋連ELISA法，對TSLXK臨床前樣品進行篩選，再以免疫清除法和交叉試驗進行確證，實驗結(jié)果顯示該檢測體系靈敏度高、重復(fù)性好、通量高，有望進一步應(yīng)用于將來的臨床試驗研究。

1 材料和方法

1.1 材料

供試品重組人鼠嵌合抗CD20 單克隆抗體（TSLXK，批號20140402）及原研對照品利妥昔單抗注射液（Rituximab Injection Mabthera，批號H0135/SH0078）均由正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司提供，每瓶100 mg/10 mL，2～8℃避光保存；陽性抗藥物抗體（鼠抗Rituximab 單抗，批號300914）購自BIO-RAD 公司，-20℃保存；空白食蟹猴血清由北京協(xié)爾鑫生物資源研究所提供；生物素標(biāo)記試劑盒購自Dojindo Molecular Technologies 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）購自R&D Systems公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

磷酸鹽 緩沖液（PBS，pH7.4）：16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶解于2 L ddH2O；封閉液：用PBS配置5%脫脂奶粉；稀釋液：用PBS 配制1%牛血清白蛋白（BSA）溶液；顯色液：TMB 底物液A 液與B 液等體積混合；1 mol/L 硫酸終止液：將20.8 mL 硫酸緩慢加入100 mL 蒸餾水中，邊加邊攪拌；PBST 洗板液：將0.5 mL Tween-20加入999.5 mL PBS中。

1.2 對照品及血清樣本制備

用含10%食蟹猴空白血清的PBS稀釋液將鼠抗Rituximab 抗體分別稀釋至320、80、10 ng/mL，作為高、中、低濃度陽性對照樣品；空白猴血清用PBS 稀釋至1/10 作為陰性對照樣品；血清樣本用PBS 稀釋至1/10待測。

1.3 篩選法（橋連ELISA法）

用PBS 磷酸鹽緩沖液將TSLXK 或Rituximab 稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔，4℃包被過夜；PBST 洗板3 次，用5%脫脂奶粉封閉，300 μL/孔，室溫孵育2 h；PBST洗板3次，拍干，分別加入100 μL待測樣品、陰性對照品及陽性對照品各3～6 孔，室溫孵育1 h；PBST洗板3次，用1% BSA稀釋生物素標(biāo)記TSLXK/Rituximab 至1/10 萬，100 μL/孔，室溫孵育1 h；PBST洗板3次，用1% BSA稀釋Streptavidin-HRP至1/200，100 μL/孔，室溫孵育20 min；PBST洗板4次，TMB 顯色，100 μL/孔，室溫反應(yīng)15 min；加終止液100 μL/孔，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定D450/560mm值。

1.4 確證法（免疫清除法）

篩選法檢測結(jié)果為陽性的樣本進一本采用此法進行確證。用PBS 將TSLXK 或Rituximab 稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔，4℃包被過夜；PBST 洗板3 次，用5%脫脂奶粉封閉，300 μL/孔，室溫孵育2 h；TSLXK初篩為陽性的食蟹猴血清樣品分別用PBS 和900 μg/mL 的TSLXK 或Rituximab 稀釋至1/10，待 測；PBST洗板3次，拍干，分別加入100 μL待測樣品、陰性對照品及陽性對照品，室溫孵育1 h；PBST 洗板3次，用1% BSA 稀釋生物素標(biāo)記TSLXK/ Rituximab至1/10 萬，100 μL/孔，室溫孵育1 h；PBST 洗板3次，用1% BSA 稀釋Streptavidin-HRP 至1/200，100 μL/孔，室溫孵育20 min；PBST洗板4次，TMB顯色，100 μL/孔，室溫反應(yīng)15 min；加終止液100 μL/孔，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定雙波長D450/560mm值。

1.5 免疫交叉

為了考察ADA 對TSLXK 和Rituximab 的免疫反應(yīng)有無差異，將初篩結(jié)果呈陽性的血清樣品交換包被藥物，重新測定。在篩選法中，TSLXK 和Rituximab 給藥組動物血清分別采用TSLXK 和Rituximab包板進行檢測；在免疫交叉反應(yīng)中，則采用TSLXK包板檢測Rituximab 給藥組動物血清，采用Rituximab包板檢測TSLXK給藥組動物血清，進而與初篩結(jié)果進行對比。

2 結(jié)果

2.1 篩選（橋連ELISA法）

2.1.1 臨界值的確定 臨界值（cut-off）是判定樣品陰陽性的臨界點，高于臨界值判定為陽性，低于臨界值則判定為陰性。對32 只健康正常食蟹猴血清樣品進行橋連ELISA法測定，樣品平行測定3次，結(jié)果見圖1。臨界值等于每批測定的血清樣品平均值加2 倍標(biāo)準差。由3 批供試品TSLXK 測得的數(shù)據(jù)得到的臨界值分別為0.0143、0.0142、0.0144，取其均值，臨界值設(shè)為0.0143；3 批原研對照品Rituximab 測得的數(shù)據(jù)得到的臨界值均為0.0124，其臨界值設(shè)為0.0124。

2.1.2 臨界值的歸一化 不同檢測批次的臨界值不盡相同，為了得到更準確的判定結(jié)果，F(xiàn)DA建議對臨界值進行歸一化。根據(jù)Anthony介紹的歸一化方法，臨界值可進行歸一化的必要條件是每批測定的血清樣本信號值（即D450/560mm值）標(biāo)準偏差一致。對32 只食蟹猴血清樣品進行3次平行檢定，經(jīng)方差分析，各組間的P值均大于0.05（置信區(qū)間95%），說明不同批次測定的血清樣品信號值標(biāo)準偏差一致，滿足歸一化條件。單一檢測批次臨界值等于本批次陰性對照樣品平均D450/560mm值+歸一化因子。其中歸一化因子為上述臨界值減去陰性對照品平均D450/560mm值，TSLXK 檢測的臨界值為0.0143，陰性血清D450/560mm值為0.0107，歸一化因子為0.0036；Rituximab檢測的臨界值為0.0124，陰性血清D450/560mm值為0.0097，歸一化因子為0.0027。

2.1.3 檢測靈敏度 本實驗采用鼠抗Rituximab 抗體作為陽性對照品，以反映該方法的靈敏度。用含10%食蟹猴空白血清的PBS緩沖液將鼠抗Rituximab抗體分別稀釋為400、200、100、50、25、12.5、6.25 ng/mL。取100 μL上述標(biāo)準樣品加入預(yù)先處理的酶標(biāo)板中（方法詳見1.3），根據(jù)標(biāo)準曲線計算臨界值所對應(yīng)的陽性抗體濃度，即為該方法的檢測限。

以濃度為橫坐標(biāo)、D450/560mm值為縱坐標(biāo)，雙對數(shù)作圖，線性回歸得到標(biāo)準曲線（圖2）。TSLXK 臨界值（0.0143）所對應(yīng)抗體濃度為0.35 ng/mL，因為血清樣品測定時須稀釋至1/10，故該方法測定血清中實際抗TSLXK抗體的檢測靈敏度為3.5 ng/mL；對照品Rituximab 臨界值（0.0124）所對應(yīng)的濃度也是0.35 ng/mL，故該方法測定血清中實際抗Rituximab 抗體的檢測靈敏度為3.5 ng/mL。

2.1.4 精密度與準確度 精密度表示測定值之間的一致性或接近程度，一般用相對標(biāo)準偏差（CV）表示；準確度表示測定值與真實值之間的符合程度，一般用相對誤差（RE）表示。對陽性高、中、低對照進行3 次重復(fù)檢測，每個濃度6 個平行孔，經(jīng)計算不同濃度樣本的板內(nèi)或板間的CV均小于10%，板內(nèi)或板間的RE均介于±10%之間（表1），說明該方法具有較高的精密度與準確度，滿足方法學(xué)要求

2.1.5 血藥濃度對檢測方法的影響 血樣中存在的藥物（TSLXK 或Rituximab）有可能會影響ADA 的檢測，因此需要考察樣品中存在的TSLXK或Rituximab對免疫原性檢測方法的影響程度。用含10%猴血清的PBS 將TSLXK 分別稀釋至5000、1000、200、40、8、1.6 μg/mL，將Rituximab 分別稀釋至320、64、12.8、2.56、0.512、0.102 ng/mL，進而用梯度稀釋的上述含藥溶液將鼠抗Rituximab 陽性抗體稀釋至320、80 和10 ng/mL，取100μL 加入已包被的酶標(biāo)板孔中。圖3 為不同濃度的TSLXK 和Rituximab 對檢測方法的影響。結(jié)果顯示，二者的影響趨勢基本相同，隨著血中TSLXK或Rituximab濃度的增高，含有陽性抗體的樣品的檢測信號值逐漸降低，當(dāng)藥物濃度增加到一定程度時，檢測信號值突降至臨界值以下，產(chǎn)生假陰性結(jié)果（本批次臨界值分別為0.0194和0.0148）。陽性樣本所含ADA 濃度越高（從10、80 到320 ng/mL），能夠耐受的血清藥物濃度越高（分別對應(yīng)12.8、64和320 ng/mL），血清藥物濃度一旦超過耐受濃度，則檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。

圖1 食蟹猴血清樣品不同檢定批次的D450/560mm值波動及分布圖（n=32）

2.2 篩選法檢測結(jié)果

表2 為食蟹猴TSLXK 重復(fù)靜脈給藥4 周、停藥恢復(fù)8 周毒性實驗中動物的分組情況，給藥期每組10 只動物（d29 前），恢復(fù)期每組4 只動物（d29 后）。表3為毒代樣本中ADA檢測結(jié)果，測定D450/560mm值大于本批次臨界值時，結(jié)果判定為陽性（+），否則判斷為陰性（-）。結(jié)果顯示TSLXK低劑量給藥組從給藥后第15 d開始陸續(xù)檢測到ADA，且動物抗體產(chǎn)生率達到90%；中劑量組僅有1 只在藥后22 d 開始檢測到抗體，另有2 只在最后一個檢測時間點產(chǎn)生抗體（d119）；高劑量組無抗體產(chǎn)生。Rituximab 陽性對照組也有1 只動物在藥后22 d 開始出現(xiàn)抗體，一直維持到實驗結(jié)束。

2.3 確證法檢測結(jié)果

采用免疫清除法確證篩選法檢測結(jié)果呈陽性的血清樣品中是否確實含有抗藥物抗體。在檢測結(jié)果呈陽性的血清樣品中加入過量TSLXK，若樣品中含有ADA，則過量的TSLXK與包被的TSLXK競爭結(jié)合ADA，洗滌過程可將該部分液相中的結(jié)合抗體去除，包被TSLXK上結(jié)合的ADA減少，最終導(dǎo)致信號值降低。若加入過量TSLXK后信號值無顯著差異，陽性結(jié)果可能是血清基質(zhì)非特異性結(jié)合所致。

圖2 供試品與對照品橋連ELISA法檢測的標(biāo)準曲線

圖3 TSLXK及Rituximab血藥濃度對橋連ELISA法檢測抗藥物抗體的影響

表1 橋連ELISA法檢測的板內(nèi)和板間精密度與準確度

對篩選法檢測結(jié)果呈陽性的各采血點血清樣品進行免疫清除試驗，結(jié)果見圖4，以不加TSLXK的檢測孔所得D450/560mm值為橫坐標(biāo)，以同一樣本加入過量TSLXK后所得D450/560mm值為縱坐標(biāo)，繪制全部44個初篩為陽性樣本的散點圖。結(jié)果顯示，不加TSLXK時，初篩為陽性的全部44個樣品點D450/560mm值均大于臨界值（0.0145），介于0.189到3.648之間；當(dāng)加入過量TSLXK后，信號值均顯著降低，僅有3個樣本點略高于臨界值，其余均轉(zhuǎn)為陰性。證實陽性樣品中確實含有抗TSLXK或Rituximab的特異性抗體。

2.4 免疫交叉反應(yīng)

TSLXK 和Rituximab 給藥組動物血清在篩選法中分別采用TSLXK和Rituximab包板進行檢測，初篩結(jié)果呈陽性的血清樣品進一步交換包被藥物，重新測定，考察ADA 對TSLXK 和Rituximab 的免疫反應(yīng)有無差異。以TSLXK 包被并檢測所得D450/560mm值為橫坐標(biāo)，同一樣本用Rituximab 包被并檢測所得D450/560mm值為縱坐標(biāo)繪圖（圖5），結(jié)果顯示供試品/原研對照品連續(xù)給藥在食蟹猴體內(nèi)均可以引發(fā)抗體產(chǎn)生，且二者與二者產(chǎn)生的抗體間存在交叉反應(yīng)。2種檢測方法均可以檢測抗體，檢測數(shù)值比較接近，在散點圖上呈現(xiàn)一定的線性回歸趨勢。

表2 TSLXK重復(fù)靜脈給藥4周、停藥恢復(fù)8周毒性實驗動物分組

2.5 抗體滴度檢測

將經(jīng)免疫確證后的陽性樣本進行一系列梯度稀釋，直至稀釋至檢測結(jié)果為陰性，則前一個滴度即為血清中抗TSLXK 和Rituximab 抗體的滴度。結(jié)果顯示食蟹猴血清抗體的滴度從1∶40～1∶1280 不等，隨時間延長，抗體滴度逐漸升高，給藥后第119 d（最后一個檢測時間點）抗體滴度達到最高值1∶1280。

3 討論

隨著基因重組技術(shù)的引入，將抗體可變區(qū)轉(zhuǎn)移至另一個抗體，使克服或減少鼠克隆抗體的某些局限性成為可能，將鼠抗體的可變區(qū)轉(zhuǎn)移至人抗體的恒定區(qū)可以明顯減少鼠源組分（大約減少2/3），從而生產(chǎn)一種被稱為嵌合單克隆抗體的抗體。這種嵌合抗體盡管大大減少了鼠源部分，但仍然存在免疫反應(yīng)。本研究建立了檢測食蟹猴血清中抗CD52 單克隆抗體免疫原性的檢測方法并進行了確證，結(jié)果顯示TSLXK與Rituximab連續(xù)給藥后，部分個體產(chǎn)生針對TSLXK和Rituximab的特異性抗體，且隨時間延長抗體滴度逐漸增高。低、中、高劑量組隨劑量的增加，抗體產(chǎn)生率明顯降低，說明連續(xù)靜脈給予抗CD20單克隆抗體后，劑量對抗體的產(chǎn)生存在較大影響，低劑量連續(xù)給藥更易誘發(fā)抗體產(chǎn)生。TSLXK 和Rituximab 相同劑量給藥后，TSLXK 沒有抗體產(chǎn)生，而對照品Rituximab 卻有1 只動物出現(xiàn)抗體，考慮到動物樣本數(shù)有限且動物本身存在較大的個體差異，要判斷差異存在，尚須進一步研究。

表3 TSLXK重復(fù)靜脈給藥4周、停藥恢復(fù)8周抗藥物抗體檢測結(jié)果

圖4 食蟹猴給藥4周恢復(fù)8周抗體陽性采血點確證法檢測結(jié)果（n=44）

圖5 食蟹猴給藥4周恢復(fù)8周抗體陽性采血點免疫交叉反應(yīng)（n=44）

由于抗CD20單抗在體內(nèi)半衰期較長，一段時期內(nèi)猴體內(nèi)會存在較高的血藥濃度，需要考察血藥濃度對ADA檢測的影響。方法學(xué)確證表明，供試品和原研對照品血清中的藥物濃度對抗體檢測的影響水平一致，陽性樣本所含ADA 濃度越高，能夠耐受的血清藥物濃度越高，血清藥物濃度一旦超過耐受濃度，則檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。藥物與ADA本質(zhì)上均為抗體，兩者分子大小接近，提示體外ELISA 實驗中，藥物與ADA 的結(jié)合比例接近1∶1，一旦血清中所含藥物超過所含ADA，即可干擾ADA 的檢測，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。血藥濃度較高時雖然對抗體檢測有影響，但只是增加了假陰性率，不會增加假陽性率，所以檢測結(jié)果為陽性的樣本是可信的。

橋連ELISA法只是作為大量臨床樣品免疫原性的初篩，若樣品檢測結(jié)果為陽性，還須采用確證法確證血清中抗CD20 單抗特異性抗體的存在。本實驗采用免疫清除作為確證方法，降低了假陽性的發(fā)生。橋連ELISA 和免疫清除法的聯(lián)合，可以更好更客觀地評價藥物的免疫原性，也是目前國內(nèi)臨床常用的方法之一。根據(jù)新的指導(dǎo)原則，免疫原性檢測過程中需要加入免疫交叉試驗，本實驗將實驗中檢測并確證為陽性抗體的樣本進行了免疫交叉試驗，結(jié)果表明，供試品/原研對照品連續(xù)給藥在食蟹猴體內(nèi)均可以引發(fā)抗體產(chǎn)生，且二者與二者產(chǎn)生的抗體間存在較高的交叉反應(yīng)率，這從另一方面證實供試品與原研對照品的結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)性高度一致。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2008[J].CA Cancer J Clin,2008,58(2):71-96.

[2]Pescovitz M D.Rituximab,an anti-CD20 monoclonal antibody:history and mechanism of action[J].Am J Transplantation,2006,6:859-866.

[3]Guidance for industry:assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins[EB/OL].http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm192750.pdf,2009.

[4]Guidance on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic protein[EB/OL].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003 46.pdf,2007.

[5]周海鈞.藥品注冊的國際技術(shù)要求（安全性部分）[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:121-134.

[6]Kelley M,Ahene A B,Gorovits B,et al.Theoretical considerations and practical approaches to address the effect of antidrug antibody on quantification of biotherapeutics in circulation[J].AAPS J,2013,15(3):646-658.

[7]Guidance for industry:bioanalytical method validation[EB/OL].http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf,2013.