劉欣欣 羅素菊 鄭焱 許文娟 李穎 劉全忠

白細(xì)胞介素22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子的作用機(jī)制探討

劉欣欣 羅素菊 鄭焱 許文娟 李穎 劉全忠

目的 探討白細(xì)胞介素22（IL-22）誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（HBEGF）的相關(guān)作用機(jī)制。方法 用不同濃度的IL-22（12.5、25、50、100μg/L）干預(yù)處理HaCaT細(xì)胞，對(duì)照組選擇等量磷酸鹽緩沖液（PBS）處理。24 h后，提取HaCaT細(xì)胞總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡，檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活因子途徑（JAK/STAT）中磷酸化 JAK2（P-JAK2）和磷酸化 STAT3（P-STAT3）的表達(dá)。將HaCaT細(xì)胞分 4組，分別用 PBS、IL-22、MAPK-ERK1/2抑制劑PD98059、JAK2/STAT3通路抑制劑AG490與IL-22共同干預(yù)HaCaT細(xì)胞，24 h后，提取細(xì)胞總蛋白和總mRNA，分別用蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法檢測(cè)不同處理組HB-EGF蛋白和mRNA水平的改變。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異，Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。結(jié)果 不同濃度的IL-22干預(yù)處理后，HaCaT細(xì)胞中P-ERK1/2、P-JAK2和P-STAT3蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.05）。HB-EGF蛋白水平（HB-EGF/內(nèi)參照的灰度比值）在PD98059組和AG490組分別為0.183±0.020和0.199±0.011，與 IL-22組（0.924±0.032）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為37.700、36.400，均P<0.05）。HB-EGF mRNA水平在PD98059組和AG490組分別為1.034±0.072和0.989±0.038，與IL-22組（1.844±0.135）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為11.271、13.429，均P<0.05）。結(jié)論 IL-22可以引起HaCaT細(xì)胞中MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號(hào)通路激活。IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生HB-EGF蛋白的作用機(jī)制可能與MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號(hào)通路有關(guān)。

白細(xì)胞介素-22；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1；角蛋白細(xì)胞；絲裂原激活蛋白激酶類；Janus激酶2；STAT3轉(zhuǎn)錄因子；銀屑??；HaCaT細(xì)胞

目前研究認(rèn)為，銀屑病的發(fā)病機(jī)制主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞為靶點(diǎn)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在其發(fā)病過程中Th17、Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素22（IL-22）為Th22細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外研究表明，銀屑病患者外周血及皮損中IL-22水平較健康人高，且IL-22水平的高低與銀屑病嚴(yán)重程度密切相關(guān)［1-3］。肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（HB-EGF）是表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在銀屑病皮損中表達(dá)增高，并且其表達(dá)量與銀屑病病情相關(guān)［4］，提示其在銀屑病表皮異常增殖中發(fā)揮重要作用。以往研究表明，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）這兩種信號(hào)通路蛋白在角質(zhì)形成細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)中至關(guān)重要［5］。我們的研究表明，IL-22可在基因和蛋白水平促進(jìn)HaCaT細(xì)胞HBEGF的表達(dá)（未發(fā)表）。在本研究中，我們檢測(cè)IL-22對(duì)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）和轉(zhuǎn)錄激活因子途徑（JAK/STAT）中磷酸化JAK2（P-JAK2）和磷酸化STAT3（P-STAT3）的影響，并通過抑制其信號(hào)傳導(dǎo)檢測(cè)其是否影響HaCaT細(xì)胞HB-EGF的表達(dá)，探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞系德國(guó)柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng)，為我實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期凍存細(xì)胞。

2.主要試劑：重組人IL-22（美國(guó)Protein Specialists 公 司），P-ERK1/2、P-JAK2、JAK2、PSTAT3、STAT3、辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）-羊抗兔的二抗（美國(guó)CST公司），β肌動(dòng)蛋白、HRP-羊抗鼠的二抗、HRP-兔抗山羊二抗（北京中杉金橋公司），ECL發(fā)光顯色液、熒光Mix（美國(guó)Invitrogen公司），PD98059、AG490（美國(guó) Millipore公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司），Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），HB-EGF抗體、HB-EGF蛋白ELISA試劑盒（美國(guó)RD公司）。HB-EGF及β肌動(dòng)蛋白的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.主要儀器：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Biotek公司），凝膠成像系統(tǒng)儀（英國(guó)Cambridge公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），CO2孵育箱（美國(guó)Forma Scientific公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.HaCaT細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)：將凍存的HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待HaCaT細(xì)胞90%融合后，用0.25%胰酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.HaCaT細(xì)胞的干預(yù)處理：將經(jīng)傳代培養(yǎng)后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，以1×105/ml接種于6孔板，37℃、5%CO2孵育培養(yǎng)。待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，進(jìn)行饑餓處理2～3 h后，更換新的培養(yǎng)液，分別用 12.5、25、50、100μg/L 重組人 IL-22 進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組用等量磷酸鹽緩沖液（PBS）干預(yù)。繼續(xù)于37℃、5%CO2孵育培養(yǎng) 24 h。

3.蛋白免疫印跡檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白：干預(yù)處理后的HaCaT細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗3遍，每孔加300μl細(xì)胞裂解液和2μl蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）。冰上裂解30min，用EP管收集細(xì)胞裂解液離心10min。測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行Western印跡。取上清，10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，每孔上樣量 25μl，電泳 90min，穩(wěn)流 300 mA 轉(zhuǎn)膜 40min，轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜分別用兔抗人一抗（PERK1/2、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3）4 ℃孵育過夜，后洗滌，用二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗）室溫孵育2 h，ECL暗室曝光顯色。檢測(cè)P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2的表達(dá)情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.細(xì)胞信號(hào)通路阻斷劑阻斷實(shí)驗(yàn)：

（1）細(xì)胞干預(yù)處理：對(duì)接種培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為4 組：①陰性對(duì)照組：PBS；②IL-22 組：50μg/L IL-22；③PD98059 組：50μmol/L PD98059+50μg/L IL-22；④AG490 組：50μmol/L AG490+50μg/L IL-22。抑制劑的選擇及使用濃度參照文獻(xiàn)［6-7］。

（2）蛋白免疫印跡檢測(cè)HB-EGF蛋白水平的改變：干預(yù)培養(yǎng)24 h后，按上述方法提取各組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡，檢測(cè)HB-EGF蛋白水平的改變。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)HB-EGF基因水平的改變：干預(yù)處理24 h后吸去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度（A260nm/A280nm），檢測(cè)RNA的純度及濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。熒光定量PCR 反應(yīng)體系：25μl，冰上加樣熒光定量 Mix12.5μl，上下游引物各 0.25μl，模板 cDNA 2μl，無 RNA 酶的雙蒸水10μl。按照試劑盒說明設(shè)定反應(yīng)條件50℃2min促使尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）激活：然后95℃，2min預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s變性，60℃1min退火延伸，40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行熔解曲線分析判定PCR反應(yīng)的特異性。HB-EGF上游引物：5′-GGCTCCCTCCTGCATCTG-3′，下游引物：5′-AGGAT GGTTGTGTGGTCATAGGT-3′。β肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上述RT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（4）ELISA法檢測(cè)HB-EGF蛋白的表達(dá)：采用雙抗體夾心ELISA法，參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度。每個(gè)樣本重復(fù)3次。制作樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并據(jù)其計(jì)算各樣品的濃度。應(yīng)用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)樣品總蛋白濃度。統(tǒng)計(jì)不同樣品HB-EGF蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

三、統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理

結(jié) 果

一、IL-22干預(yù)后HaCaT細(xì)胞中P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，12.5、25、50、100μg/L IL-22干預(yù)處理后，HaCaT細(xì)胞MAPK通路中P-ERK1/2表達(dá)量、JAK2/STAT3通路中P-STAT3表達(dá)量、PJAK2表達(dá)量均較對(duì)照組升高（表1），且與IL-22濃度有一定相關(guān)關(guān)系。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似（圖1、2）。參照課題組前期研究及信號(hào)通路蛋白表達(dá)選擇50μg/L的IL-22進(jìn)行信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)。

表1 IL-22干預(yù)后HaCaT細(xì)胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表達(dá)量（與β肌動(dòng)蛋白灰度比值，±s）

表1 IL-22干預(yù)后HaCaT細(xì)胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表達(dá)量（與β肌動(dòng)蛋白灰度比值，±s）

注：n=3

組別 P-ERK1/2 P-STAT3 P-JAK2 IL-22干預(yù)組12.5μg/L 0.588±0.043 0.755±0.091 0.358±0.069 25μg/L 0.625±0.032 0.823±0.060 0.454±0.053 50μg/L 0.857±0.068 0.906±0.097 0.531±0.093 100μg/L 0.975±0.057 0.984±0.119 0.843±0.078對(duì)照組 0.324±0.108 0.460±0.106 0.130±0.017 F值 42.55 13.01 44.95 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 白細(xì)胞介素22（IL-22）對(duì)HaCaT細(xì)胞MAPK通路蛋白ERK及P-ERK表達(dá)的影響 1：對(duì)照組；2～5：分別為12.5、25、50、100μg/L IL-22 組

圖2 白細(xì)胞介素22（IL-22）對(duì)HaCaT細(xì)胞JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)的影響 1：對(duì)照組；2～5：分別為12.5、25、50、100μg/L IL-22組

圖3 部分信號(hào)通路阻斷HaCaT細(xì)胞中肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子的表達(dá) 1：對(duì)照組；2：50μg/L IL-22；3：50μg/L IL-22+PD98059；4：50μg/L IL-22+AG490

二、通路阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.加入信號(hào)通路阻斷劑后HB-EGF蛋白水平的改變：蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在加入信號(hào)通路阻斷劑后，HB-EGF蛋白表達(dá)量（HB-EGF/β肌動(dòng)蛋白灰度比值）PD98059組為0.183±0.020，較IL-22組（0.924±0.032） 降低（F=37.700，P＜0.05）；AG490組（0.199±0.011）也較IL-22組降低（F=36.400，P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

2.加入信號(hào)通路阻斷劑后HB-EGF mRNA水平的變化：加入信號(hào)通路阻斷劑后HB-EGF mRNA表達(dá)水平均較IL-22組減少。PD98059組HB-EGF mRNA表達(dá)水平（2-ΔΔCt）為1.034±0.072，較IL-22組（1.844±0.135）降低（F=11.271，P<0.05）；同時(shí)AG490組（0.989±0.038）較IL-22組亦降低（F=13.429，P<0.05）。

三、不同干預(yù)處理組HB-EGF蛋白的濃度與總蛋白濃度的比值

在加入信號(hào)通路抑制劑后，HB-EGF蛋白表達(dá)均較IL-22組降低。HB-EGF與總蛋白濃度比值在對(duì)照組為（0.816±0.152）× 10-3，PD98059 組為（0.852±0.159）×10-3，AG490組為（1.049±0.166）×10-3，后兩組與 IL-22組（2.067±0.160）× 10-3比較均降低，F(xiàn)值分別為20.933、5.414，均P<0.05。

討 論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，IL-22可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞MAPK信號(hào)通路中P-ERK1/2蛋白表達(dá)增加，加入MAPK-ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059后，HB-EGF蛋白和mRNA的表達(dá)較未加抑制劑組明顯降低。提示MAPK-ERK1/2信號(hào)通路在IL-22促進(jìn)HB-EGF的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。同樣濃度IL-22干預(yù)后，JAK2/STAT3信號(hào)通路中P-JAK2和P-STAT3蛋白水平均明顯升高。加入JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后，HB-EGF無論從蛋白水平還是基因水平均較無抑制組降低。

有研究顯示，IL-22可通過促進(jìn)HaCaT細(xì)胞PERK1/2和P-STAT3升高進(jìn)而引起角蛋白17升高［8］。HB-EGF可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移。研究表明，HB-EGF在正常皮膚表皮中不表達(dá)或表達(dá)量很低，而在銀屑病患者皮損中表達(dá)升高，其表達(dá)水平與銀屑病的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，提示其在銀屑病表皮異常增殖中發(fā)揮重要作用［9］。IL-22受體廣泛分布于免疫細(xì)胞中，參與調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其他組織細(xì)胞的增殖和分化，尤其在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化及免疫中起重要作用［10］。在銀屑病皮損中IL-22受體較正常皮膚增多，提示IL-22受體參與銀屑病的表皮異常增殖［11］。因此我們推測(cè)IL-22通過與HaCaT細(xì)胞表面IL-22受體結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)通路激活。

銀屑病皮損的棘層和基底層角質(zhì)形成細(xì)胞中存在ERK1/2的磷酸化，并且與角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖相關(guān)［12-13］。另外，ERK1/2的磷酸化可促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖和抗凋亡作用［14］。研究表明，在銀屑病患者的皮損中STAT3表達(dá)明顯升高［15-16］。在銀屑病患者機(jī)體內(nèi)STAT3參與Th17細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程，與角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和炎性浸潤(rùn)有關(guān)［17］。

綜上所述，IL-22可使HaCaT細(xì)胞HB-EGF、PERK1/2蛋白、P-JAK2和P-STAT3蛋白水平升高。MAPK-ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059和JAK2/STAT3通路抑制劑AG490可明顯抑制HBEGF的表達(dá)，提示IL-22可能通過MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條通路誘導(dǎo)HB-EGF的表達(dá)。提示阻斷IL-22信號(hào)通路傳導(dǎo)可減少HB-EGF的表達(dá)，進(jìn)一步研究可能為治療銀屑病提供一個(gè)新的治療途徑。

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2014-04-24）

（本文編輯：尚淑賢）

Mechanisms underlying interleukin-22-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor in HaCaT cells

Liu Xinxin*,Luo Suju,Zheng Yan,Xu Wenjuan,Li Ying,Liu Quanzhong.*Department of Dermatology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

Luo Suju,Email:luosuju2005@163.com

ObjectiveTo investigate the mechanisms underlying interleukin-22（IL-22）-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor（HB-EGF）in HaCaT cells.MethodsSome HaCaT cells were divided into several inverention groups treated with IL-22 at concentrations of 12.5,25,50,100μg/L,respectively and a control group treated with phosphate buffer saline （PBS）.After 24-hour culture,total proteins were extracted from the HaCaT cells,and Western blot was performed to measure the expression of phosphorylated extracellular signalregulated kinase 1/2 （P-ERK1/2）in the mitogen-activated protein kinase （MAPK）-ERK1/2 pathway,as well as phosphorylated-JAK2（P-JAK2）and phosphorylated-signal transducer and activator of transcription 3 （P-STAT3）in the JAK2/STAT3 pathway.In a blocking experiment,some HaCaT cells were divided into 4 groups to be treated with PBS,IL-22,PD98059 （an inhibitor of MAPK-ERK1/2）combined with IL-22 （PD98059 group）,AG490 （an inhibitor of JAK2/STAT3）combined with IL-22 （AG490 group）,respectively.After 24-hour treatment,total proteins and mRNAs were extracted from the HaCaT cells followed by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR for the measurement of protein and mRNA expressions of HB-EGF respectively.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 16.0 by one-way analysis of variance （ANOVA）for intergroup comparisons and by Bonferroni′s test for multiple comparisons.ResultsAfter treatment with IL-22 at the above 4 concentrations,the expressions of P-ERK1/2,P-JAK2 and P-STAT3 in HaCaT cells were all increased compared with the control group（allP<0.05）.The protein and mRNA expression levels（expressed as the HB-EGF/β-actin ratio and 2-△△Ctrespectively）of HB-EGF were both significantly decreased in the PD98059 group and AG490 group than in the IL-22 group（protein:0.183±0.020 and 0.199±0.011 vs.0.924±0.032,F=37.700,36.400,respectively,bothP＜0.05;mRNA:1.034±0.072 and 0.989±0.038 vs.1.844±0.135,F=11.271,13.429,respectively,bothP＜0.05）.ConclusionsIL-22 can activate the MAPK-ERK1/2 and JAK2/STAT3 signaling pathways in HaCaT cells,which may contribute to IL-22-induced expression of HB-EGF in HaCaT cells.

Interleukin-22;Fibroblast growth factor 1;Keratinocytes;Mitogen-activated protein kinases;Janus kinase 2;STAT3 transcription factor;Psoriasis;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.009

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201231、81371732）

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科（劉欣欣、羅素菊、許文娟、劉全忠），肺癌研究所（李穎）；西安交通大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科（鄭焱）

羅素菊，Email：luosuju2005@163.com