胡彩霞 趙連梅 張國強(qiáng) 田菲 王文氫 高順強(qiáng)

2-甲氧基雌二醇對惡性黑素瘤B16細(xì)胞株增殖與凋亡的影響

胡彩霞 趙連梅 張國強(qiáng) 田菲 王文氫 高順強(qiáng)

目的 探討2-甲氧基雌二醇（2-ME）對小鼠惡性黑素瘤B16細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并初步探討其機(jī)制。方法 選用小鼠B16細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，實驗分為陰性對照組和藥物處理組，藥物處理組加入2-ME，使其終濃度分別為5、10、20、40μmol/L，陰性對照組不加2-ME。作用不同時間后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；根據(jù)磺酰羅丹明B方法測得的各組A490值繪制生長曲線；采用磺酰羅丹明B法檢測黑素瘤細(xì)胞活性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡；逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時PCR法分析凋亡誘導(dǎo)基因（gadd45b）及原癌基因（c-myc）的表達(dá)情況。結(jié)果 重復(fù)測量的方差分析顯示，5、10、20、40μmol/L的2-ME作用于黑素瘤細(xì)胞不同時間后對其增殖的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1170.94，P<0.01）；上述濃度的2-ME作用24、48、72 h對黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1843.04，P<0.01）；藥物濃度和培養(yǎng)時間存在交互作用（F=272.79，P<0.01）。10、20、40μmol/L 2-ME作用48 h后，B16細(xì)胞的凋亡率分別上升至（4.13±1.12）%、（11.25±2.38）%、（19.46±2.9）%，與陰性對照組［（0.23±0.5）%］相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，對照組細(xì)胞、10、20、40μmol/L 2-ME 處理組細(xì)胞 G0/G1 期比例分別為（44.1±3.4）%、（59.5±5.6）%、（63.4±8.2）%、（70.8±4.4）%，且隨著濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，各處理組及對照組間比較，G0/G1期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.56，P<0.05）。與陰性對照組相比，20μmol/L和40μmol/L 2-ME作用24 h可升高gadd45b的表達(dá)（均P<0.01），10、20、40μmol/L 2-ME均可降低c-myc基因的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論 2-ME在體外能夠抑制小鼠惡性黑素瘤B16細(xì)胞的增殖，能夠使c-myc基因的表達(dá)降低，使gadd45b基因的表達(dá)升高。

雌二醇；黑色素瘤，實驗性；細(xì)胞系，腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；基因,myc；Gadd45基因

惡性黑素瘤早期及時手術(shù)治療可以挽救生命，晚期治療常不易控制病情的發(fā)展，一旦發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移，將會危及生命。因為腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生，惡性黑素瘤對達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺、鉑類、長春新堿、紫杉醇等化療藥物可產(chǎn)生耐藥性［1］，多種化療方案治療均不理想［2］，亟待新的治療藥物的出現(xiàn)。2-甲氧基雌二醇（2-ME）是人體內(nèi)17-β雌二醇的代謝產(chǎn)物，體外研究發(fā)現(xiàn)，其具有潛在的抗多種腫瘤的活性，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等［3-5］。但關(guān)于2-ME對黑素瘤的研究國內(nèi)尚未見報道。我們觀察2-ME對黑素瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為該藥物的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料和試劑

2-ME產(chǎn)自美國Cayman公司（批號0433445-9，純度≥95%）。胎牛血清產(chǎn)自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640和胰蛋白酶產(chǎn)自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）產(chǎn)自天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；碘化丙錠（PI）染料產(chǎn)自杭州聯(lián)科生物工程有限公司；磺酰羅丹明B（sulphorhodamine B，SRB） 試劑盒產(chǎn)自美國 Sigma公司；瑞－姬（Wright-Giemsa）染液產(chǎn)自珠海Baso公司（批號：18610）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；q-PCR染料SYBgreen產(chǎn)自大連TaKaRa公司；無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑素瘤B16細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

三、SRB法檢測B16細(xì)胞增殖

實驗分為對照組和處理組，以不含細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)液為空白組。取對數(shù)生長期B16細(xì)胞懸浮于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/ml，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，細(xì)胞貼壁后，對照組加入含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，藥物處理組加入不同濃度的 2-ME 10μl，使其終濃度分別為5、10、20、40μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 和 72 h 后，棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，10%三氯乙酸4℃固定1 h，蒸餾水沖洗4～5遍，室溫晾干，加4 g/L SRB染液100μl染色15min，棄染液，1%乙酸輕洗4～5遍，滴加100μl 10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Trisbase），搖床上搖晃15min，于492 nm處測吸光度值（A值），每一濃度設(shè)立3個復(fù)孔，取平均值。倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，全自動酶標(biāo)儀于492 nm波長處測定各孔吸光度A值，按下式計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1－實驗組A值/對照組A值）×100%。

四、SRB法繪制生長曲線

實驗分為對照組和處理組，取對數(shù)生長期B16細(xì)胞懸浮于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104/ml，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，細(xì)胞貼壁后，對照組加入含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，藥物處理組加入不同濃度的 2-ME 10μl，使其終濃度分別為10、20、40μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6 d，收集細(xì)胞，SRB法測A490值，繪制生長曲線。

五、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期B16細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗組加入2-ME，終濃度分別為10、20、40μmol/L，對照組加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min（離心半徑13.5cm）離心5min，PBS洗滌3次，每次離心 5min，用2ml PBS 重懸細(xì)胞 5min ，加入10μlPI，室溫反應(yīng)10min，4℃避光染色30min，用流式細(xì)胞儀經(jīng)Single histogram statistic軟件分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。每個濃度樣本重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示。

六、逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）和實時定量PCR（real time PCR）檢測凋亡相關(guān)基因c-myc和生長阻滯與DNA損傷誘導(dǎo)基因45b（gadd45b）的表達(dá)

細(xì)胞分組同細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期檢測試驗。取對數(shù)生長期B16細(xì)胞，加入6 mg/L對羥基桂皮醛，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，加入相應(yīng)目的基因的上下游引物（表1）和qRT-PCR染料后，用ABI 7500定量PCR儀進(jìn)行檢測。實時定量PCR反應(yīng)條件：95℃5min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（40個循環(huán)）。70～99℃每度8個熒光采集點繪制熔解曲線。普通RTPCR的反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃15s，60℃30s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃7min，4℃保存。用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件

七、數(shù)據(jù)處理

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析和重復(fù)測量的方差分析統(tǒng)計組間和組內(nèi)差異，其中兩兩組間比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2-ME對黑素瘤B16細(xì)胞增殖的影響

重復(fù)測量的方差分析顯示，5、10、20、40μmol/L的2-ME作用于B16細(xì)胞不同時間后對其增殖的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1170.94，P＜0.01）；上述濃度的 2-ME 作用 24、48、72 h，對黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1843.04，P＜0.01）；藥物濃度和培養(yǎng)時間存在交互作用（F=272.79，P＜0.01）（圖1）。2-ME 作用于 B16細(xì)胞后，對其增殖產(chǎn)生持續(xù)的抑制作用，從第2天開始，2-ME處理組細(xì)胞明顯減少，生長曲線見圖2。

圖1 不同濃度2-甲氧基雌二醇（2-ME）對小鼠黑素瘤B16細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 不同濃度2-甲氧基雌二醇（2-ME）對小鼠黑素瘤B16細(xì)胞生長曲線的影響

二、2-ME作用后B16細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞呈貼壁生長，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞透明飽滿，呈多邊形，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚；經(jīng) 10、20、40μmol/L 2-ME 作用48 h后，隨著2-ME濃度的增加，變圓、固縮的細(xì)胞逐漸增加，呈漂浮狀生長的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。見圖3。

圖3 光鏡下觀察2-甲氧基雌二醇（2-ME）處理小鼠黑素瘤B16細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×200） 3A：對照組細(xì)胞；3B～3D：不同濃度 2-ME（10、20、40μmol/L）處理 48 h 后的細(xì)胞

三、2-ME對B16細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，對照組B16細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的凋亡率為（0.23±0.5）%，而10、20、40μmol/L 2-ME處理的凋亡率分別為（4.13±1.12）%、（11.25±2.38）%、（19.46±2.91）%。 隨著 2-ME 濃度的增加，B16細(xì)胞的凋亡率明顯上升，方差分析顯示，各處理組及對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.10，P＜0.01），兩兩比較顯示，10μmol/L 2-ME處理組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

四、2-ME對B16細(xì)胞周期分布的影響

不同濃度2-ME作用于B16細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn) G0/G1 期阻滯，對照組細(xì)胞、10、20、40μmol/L 2-ME處理組細(xì)胞G0/G1期比例分別為（44.1±3.4）% 、（59.5±5.6）% 、（63.4±8.2）% 、（70.8±4.4）%，且隨著濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，各處理組及對照組間比較，G0/G1期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.56，P＜0.05），兩兩比較顯示，10μmol/L與20μmol/L 2-ME組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同濃度2-甲氧基雌二醇（2-ME）作用48 h對小鼠黑素瘤B16細(xì)胞周期分布的影響

圖5 不同濃度2-甲氧基雌二醇（2-ME）作用小鼠黑素瘤B16細(xì)胞24 h對基因表達(dá)的影響 5A：逆轉(zhuǎn)錄-PCR實驗結(jié)果；5B：實時定量 PCR 結(jié)果。與對照組比較，a：P＜0.01，b：P＜0.05

五、2-ME對gadd45b和c-myc基因表達(dá)的影響

作用于B16細(xì)胞24 h后，3個實驗組及對照組gadd45b基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.98，P＜0.05）。其中，與對照組比較，20μmol/L 和40μmol/L 2-ME處理組均可明顯升高 gadd45b mRNA 的表達(dá)（均P＜0.01），而 10μmol/L 2-ME 對其表達(dá)沒有影響。3個實驗組及對照組c-myc基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.64，P＜0.05）；其中，與對照組比較，10、20、40μmol/L 2-ME均可降低c-myc基因的表達(dá)（均P＜0.05），見圖5。

討 論

2-ME是體內(nèi)17-β雌二醇的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，其可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，包括多發(fā)性骨髓瘤［3］、白血?。?］、食管癌［6］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［7］、乳腺癌［8］、結(jié)腸癌［9］等，而對正常的細(xì)胞不產(chǎn)生影響。目前廣泛認(rèn)同的其抗腫瘤作用機(jī)制包括抑制血管生成［10］，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11-12］等。Dobos等［13］研究發(fā)現(xiàn)，10～50μmol/L 2-ME對8種人黑素瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞G2/M周期阻滯，機(jī)制可能包括破壞微管、線粒體及激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。我們的研究證實，10～40μmol/L 2-ME對小鼠黑素瘤B16細(xì)胞具有增殖抑制作用，且該作用呈時間和濃度依賴性。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，2-ME具有誘導(dǎo)小鼠黑素瘤B16細(xì)胞凋亡的作用，隨著2-ME濃度的增加，變圓、固縮的細(xì)胞逐漸增加，呈漂浮狀生長的細(xì)胞逐漸增多，其機(jī)制與2-ME誘導(dǎo)惡性黑素瘤細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。我們還檢測凋亡相關(guān)蛋白c-myc和gadd45b的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)2-ME能明顯下調(diào)原癌基因c-myc的表達(dá)，使gadd45b表達(dá)升高，從而進(jìn)一步闡述了2-ME的作用機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)，40μmol/L 2-ME作用細(xì)胞48 h后對其增殖抑制率約40%，細(xì)胞凋亡率約為20%，說明2-ME對惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖抑制作用可能還與其他死亡形式如誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和自噬有關(guān)，尚待進(jìn)一步的實驗研究。

Gadd45家族是DNA損傷修復(fù)的重要相關(guān)基因，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生存中發(fā)揮作用。Gadd45基因能夠與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）結(jié)合，從而影響DNA損傷修復(fù)，通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）/細(xì)胞周期蛋白B（cyclin B）復(fù)合物及CR6相互作用因子（CRIF1）控制細(xì)胞周期，通過調(diào)控JNK及P53來抑制細(xì)胞生長及促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程，并且通過影響NF-κB和JNK之間的通路調(diào)控細(xì)胞凋亡［14］。Gadd45表達(dá)升高，能夠明顯地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的［15］，Gadd45基因成為腫瘤治療的一個新的靶點。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)2-ME處理過的B16細(xì)胞，Gadd45基因的表達(dá)升高，證明2-ME能抑制B16細(xì)胞的增殖可能與Gadd45基因有關(guān)，但尚需深入的實驗研究。

C-myc基因是myc基因家族的重要成員，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族下游的重要蛋白之一，也是一種可使細(xì)胞無限增殖獲永生化功能并促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，它的表達(dá)產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化中發(fā)揮作用［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，2-ME 能下調(diào)c-myc基因的表達(dá)，說明2-ME對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用與c-myc基因的表達(dá)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，2-ME能夠明顯抑制小鼠黑素瘤B16細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。2-ME有希望作為一種新的方法用于治療惡性黑素瘤，但其作用機(jī)制尚需深入研究。

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2014-03-06）

（本文編輯：尚淑賢）

Effects of 2-methoxyestradiol on the proliferation and apoptosis of B16 malignant melanoma cells

Hu Caixia*,Zhao Lianmei,Zhang Guoqiang,Tian Fei,Wang Wenqing,Gao Shunqiang.*Department of Dermatology,Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

Gao Shunqiang,Email:gshunqiang@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of 2-methoxyestradiol （2-ME）on the proliferation and apoptosis of a mouse malignant melanoma cell line B16,and to explore their mechanism.MethodsB16 cells were culturedin vitro,and divided into a negative control group receiving no treatment and several intervention groups treated with 2-ME at final concentrations of 5,10,20,40 mmol/L,respectively.After different durations of treatment,inverted phase-contrast microscopy was conducted to observe the morphologic change of B16 cells,sulforhodamine B（SRB）assay to evaluate proliferative activity and to draw growth curve of B16 cells according to the absorbance value at 490 nm,flow cytometry to detect cell cycle and apoptosis,and reverse transcription PCR and real-time PCR were performed to measure the expressions of the apoptosis-inducing gene gadd45b and proto-oncogene c-myc.ResultsAs repeated measures analysis of variance showed,there were significant differences in the inhibitory effect on B16 cell proliferation among different concentrations（5,10,20,40 mmol/L）and different treatment durations（24,48,72 hours）of 2-ME（F=1170.94,1843.04,respectively,bothP<0.01）,and there was a significant interaction effect between these concentrations and treatment durations （F=272.79,P<0.01）.After 48-hour treatment with 2-ME at 10,20 and 40 mmol/L,the apoptosis rate of B16 cells was increased to （4.13±1.12）%,（11.25±2.380）%and （19.46±2.9）%respectively,compared to （0.23±0.5）%in the negative control group （allP<0.01）;the proportion of B16 cells in G0/G1 phase was increased to（59.5±5.6）%,（63.4±8.2）%and（70.8±4.4）%respectively,compared to（44.1±3.4）%in the negative control group.There was a significant difference in the proportion of B16 cells in G0/G1 phase among the negative control group and intervention groups （F=13.56,P<0.05）.Moreover,the mRNA expression of gadd45b was significantly enhanced after 24-hour treatment with 2-ME at concentrations of 20 and 40 mmol/L（bothP＜0.01）,while that of c-myc was significantly weakened after treatment with 2-ME at 10,20 and 40 mmol/L （all＜0.05）compared with the negative control group.Conclusion 2-ME can inhibit the proliferation of B16 cellsin vitro,upregulate the expression of gadd45b gene and downregulate the expression of C-myc gene.

Estradiol;Melanoma,experimental;Cell line,tumor;Cell proliferation;Apoptosis;Genes,myc;Gadd45 gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.006

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題（20130252）

050011石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科（胡彩霞、張國強(qiáng)、王文氫、高順強(qiáng)），科研中心（趙連梅）；河北省邢臺市人民醫(yī)院皮膚科（田菲）

高順強(qiáng)，Email：gshunqiang@medmail.com.cn