張 橋，謝月萍，張春麗，周碧燕，施 勇，趙 陽

（南寧市第一人民醫(yī)院，1．老年病科；2．檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530022）

ApoA5 IVS3+476G＞A基因多態(tài)性與ApoA5水平及腦梗死的關(guān)系

張 橋1，謝月萍1，張春麗1，周碧燕2，施 勇1，趙 陽1

（南寧市第一人民醫(yī)院，1．老年病科；2．檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530022）

目的 探討載脂蛋白A5（ApoA5）IVS3+476G＞A基因多態(tài)性與血清ApoA5水平及腦梗死的關(guān)系。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對急性腦梗死患者135例及對照組患者130例的血清ApoA5濃度進(jìn)行檢測，并通過聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性長度多態(tài)性方法對ApoA5 IVS3+476G＞A基因多態(tài)性進(jìn)行檢測。結(jié)果 腦梗死組的血甘油三酯（TG）水平高于對照組，而ApoA5水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腦梗死組中的GA/AA基因型頻率及A等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GA/AA基因型的ApoA5水平低于GG基因型，而TG水平高于GG基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 ApoA5 IVS3+476G＞A位點(diǎn)影響ApoA5及TG水平，并且增加腦梗死發(fā)病的風(fēng)險。

腦梗死；ApoA5；IVS3+476G＞A基因多態(tài)性；甘油三酯

缺血性腦卒中是腦血管病最常見的類型，約占全部腦血管病的80%。最近的研究顯示，腦卒中是導(dǎo)致中國城鄉(xiāng)居民死亡的第一位原因[1]，而動脈粥樣硬化在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。TG升高是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素，而ApoA5基因是一種有力的TG調(diào)節(jié)子。大量研究表明，ApoA5基因與TG表達(dá)成負(fù)相關(guān)[2]。ApoA5基因在國內(nèi)外已有研究，主要集中在與血脂代謝、動脈粥樣硬化及冠心病方面，其基因研究位點(diǎn)主要是-1131T＞C、C56G，亦有少量文獻(xiàn)報道ApoA5基因變異與腦梗死關(guān)系[3-4]，而IVS3+476G＞A位點(diǎn)與腦梗死的關(guān)系尚未見有文獻(xiàn)報道。在本研究中，我們以急性腦梗死患者135例作為研究對象，檢測ApoA5 水平以及其基因ApoA5 IVS3+476G＞A位點(diǎn)的多態(tài)性，分析ApoA5 IVS3+476G＞A基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我科2010年1月～2014年12月收治的患者135例為腦梗死組，全部患者均符合1995年全國第四次腦血管學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]（包括病史、體檢及頭顱影像學(xué)CT或MRI檢查確診）。其中男95例，女40例，平均年齡（57.8±12.2）歲；對照組為隨機(jī)選取同期收住我科的非腦梗死患者130例，其中男90例，女40例，平均年齡（56.3±13.1）歲。兩組患者均為漢族，年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、喝酒、教育水平、高血壓、冠心病、糖尿病、等臨床特征比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。排除合并有腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦腫瘤、腦血管畸形、感染、肝腎功能損害、血液系統(tǒng)疾病患者。

1.2 研究方法

標(biāo)本采集及檢測：所有患者于入院后第二天清晨空腹抽取靜脈血兩管，每管3 mL，其中一管不抗凝，待血液凝固后，以3000 r/min離心10 min，分離血清?？偰懝檀迹═C）和TG的檢測采用雙試劑酶法，標(biāo)準(zhǔn)酶試劑盒購自英國RANDOX 公司；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）應(yīng)用酶聯(lián)免疫一步法測定，試劑盒由日本第一化學(xué)藥品株式會社提供；Apo A5 采用免疫透射比濁法，試劑盒購自英國RANDOX 公司。全部測定工作在我院檢驗(yàn)科進(jìn)行，使用日立7170全自動生化分析儀檢測。另一管用EDTA抗凝，采用低滲法裂解紅細(xì)胞后離心提取白細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取DNA（由ABI公司提供）。

引物設(shè)計與PCR：根據(jù)APOA5基因的IVS3+476G＞A位點(diǎn)的核苷酸堿基序列設(shè)計引物，正義鏈：5’-CTC AAG GCT GTC TTC AG-3’，反義鏈：5’-CCT TTG ATT CTG GGG ACTG G-3’（上海生工生物工程有限公司合成）。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系10 μL中含有模板基因組1.0 μL，2.5×buffer（含Mg2+）4.0 μL，4×dNTP 4.7 μL，taq酶0.1 μL，引物各0.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物約10 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果為一條大小約280 bp的目標(biāo)條帶。

基因型分析：取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行酶切，內(nèi)切酶Fau I（由NEB公司提供）。酶切總反應(yīng)15 μL反應(yīng)體系，其中包括：PCR產(chǎn)物5 μL，10×NEB緩沖液1.5 μL，內(nèi)切酶0.8 μL。反應(yīng)條件：55℃溫育3 h，2%瓊脂糖凝膠電泳。酶切結(jié)果：純合子GG型為141 bp、114 bp、25 bp大小的三個條帶；雜合子GA型為141 bp、73 bp、41 bp、25 bp大小的四個條帶；純合子AA型為73 bp、41 bp大小的兩條帶。為進(jìn)一步驗(yàn)證PCR結(jié)果，將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物送中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司進(jìn)行基因測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所收集資料使用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)。計數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者血脂和ApoA5水平比較

腦梗死組的TG水平高于對照組（P＜0.05），ApoA5水平低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者血脂和ApoA5水平比較（±s）

表1 兩組患者血脂和ApoA5水平比較（±s）

項(xiàng)目 腦梗死組（n=135）對照組（n=130） t P TG（mmol/L） 2.74 ±1.12 2.10±1.03 4.8368 0.0000 TC（mmol/L） 5.75±1.05 5.63±1.02 0.9432 0.3465 LDL-C（mmol/L） 3.37±0.96 3.29±1.03 0.6543 0.5135 HDL-C（mmol/L） 1.26±0.37 1.33±0.42 1.4410 0.1508 Apo A5 3.73±1.13 4.31±1.07 4.2871 0.0000

2.2 基因突變頻率比較

腦梗死組的APOA5基因IVS3+476G＞A位點(diǎn)的GA/AA基因型頻率及A等位基因頻率高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者APOA5基因 IVS3+476G＞A位點(diǎn)基因頻率分布差異 [n（%）]

2.3 不同ApoA基因 IVS3+476G＞A位點(diǎn)之間血脂水平比較

GA/AA基因型的ApoA5水平低于GG基因型（P＜0.05），而TG水平明顯高于GG基因型（P＜0.05）。見表3。

表3 APOA5基因IVS3+476G＞A位點(diǎn)患者之間血脂及ApoA5水平比較（±s）

表3 APOA5基因IVS3+476G＞A位點(diǎn)患者之間血脂及ApoA5水平比較（±s）

項(xiàng)目 TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）HDL（mmol/L） ApoA5 GG 5.35±0.95 2.23±1.1 3.36±0.97 1.35±0.454.36±1.09 GA/AA 5.28±1.03 2.72±1.07 3.38±1.041.28±0.383.62±1.18 t 0.5754 3.6739 0.1620 1.3656 5.3056 P 0.5655 0.0003 0.8715 0.1732 0.0000

3 討 論

ApoA5基因位于人類的染色體11 q23，長約2.5 kb，與載脂蛋白A1/C3/A4基因簇緊密相連，組成一個基因家族。ApoA5由肝臟特異性表達(dá)，分泌于血漿后存在于高密度脂蛋白（HDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）及乳糜顆粒中，生理情況下血液中ApoA5濃度極低，僅有（114～258）μg/L。ApoA5主要影響血漿TG代謝并呈負(fù)相關(guān)。Pennacchio等[6]的實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)ApoA5基因的小鼠血漿TG濃度比ApoA5基因敲除小鼠降低65%，而敲除ApoA5基因的小鼠的血清TG水平比野生型小鼠升高4倍，但這兩種小鼠模型的TC和HDL的濃度均無明顯變化；敲除純合子基因的小鼠的VLDL水平升高，相反，轉(zhuǎn)染ApoA5基因的小鼠VLDL水平下降；而敲除雜合子基因的小鼠的VLDL水平介于純合子基因敲除小鼠和野生型小鼠之間，以上這些結(jié)果均表明ApoA5基因?qū)G有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者ApoA5和HDL水平明顯低于對照組，而TC、TG、LDL明顯高于對照組，提示血脂異常與腦梗死發(fā)病密切相關(guān)。然而，其機(jī)制尚未明確，目前較多的觀點(diǎn)認(rèn)為ApoA5可能通過以下三種途徑影響TG代謝：①激活TG代謝中的關(guān)鍵酶-脂蛋白脂酶（LPL），從而促進(jìn)TG的分解。在細(xì)胞外途徑中，ApoA5可通過影響脂蛋白LPL促進(jìn)血TG的清除。ApoA5作為LPL異構(gòu)激活劑，可通過變構(gòu)效應(yīng)而促進(jìn)LPL與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白（HSPG）結(jié)合，增加含TG豐富的脂蛋白與HSPG-LPL復(fù)合物相互接觸的機(jī)會，有利于LPL對富含TG的脂蛋白，如VLDL和乳糜微粒（CM）的水解作用，從而使TG水平降低；而缺乏LPL的過表達(dá)ApoA5基因的小鼠的TG水平無明顯變化，提示ApoA5激活LPL調(diào)節(jié)TG的代謝。而Huang等的研究[8]進(jìn)一步證實(shí)了ApoA5通過穩(wěn)定LPL二聚體而增加其脂解活性。②阻礙肝臟中VLDL的裝配，抑制其合成和分泌。Shu等[9]認(rèn)為ApoA5可作為肝細(xì)胞輸出脂類的控制開關(guān)，有延緩VLDL裝配和進(jìn)入分泌途徑的作用。③增強(qiáng)VLDL與低密度脂蛋白（LDL）受體的親和力，從而促進(jìn)肝臟攝取脂質(zhì)顆粒。因此，ApoA5水平降低可導(dǎo)致血管內(nèi)皮脂質(zhì)積累及動脈粥樣斑塊形成，并最終增加缺血性腦卒中發(fā)生的風(fēng)險。

多項(xiàng)研究表明，ApoA5基因多態(tài)性與TG升高、冠心病、腦梗死及代謝性疾病有一定的關(guān)聯(lián)性且存在種族及地域差異[10-12]。Maasz等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，ApoA5 IVS3+476G＞A基因型是所有缺血性卒中的危險因素，其機(jī)制主要是通過提高TG水平，加速動脈粥樣硬化進(jìn)程，從而增加缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險。目前國內(nèi)尚無研究報道ApoA5基因 IVS3+476G＞A位點(diǎn)與腦梗死的關(guān)系，中國漢族人群的缺血性腦卒中患者的是否也與與ApoA5基因 IVS3+476G＞A位點(diǎn)變異有關(guān)尚未明確。為此，我們通過對135例腦梗死和130例非腦梗死的漢族患者進(jìn)行研究，結(jié)果表明腦梗死組中的APOA5基因 IVS3+476G＞A位點(diǎn)的GA/AA基因型頻率及A等位基因頻率顯著高于對照組 （P＜0.05）；GA/AA基因型的ApoA5水平明顯低于GG基因型（P＜0.05），而GG/AA基因型的TG水平明顯高于GG基因型（P＜0.05）。與國外關(guān)于白種人的IVS3+476G＞A位點(diǎn)突變作為腦梗死危險因素的研究結(jié)果相似。但由于例數(shù)較少，尚不能準(zhǔn)確的反映APOA5基因IVS3+476G＞A位點(diǎn)是否在我國漢族人群中存在突變，更無法進(jìn)一步研究此位點(diǎn)突變是否與腦梗死的發(fā)生有關(guān)，有待進(jìn)一步的大樣本研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者中ApoA5水平降低，而ApoA5水平降低可能在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。ApoA5基因IVS3+476G＞A位點(diǎn)影響ApoA5及TG水平，并且增加腦梗死發(fā)病風(fēng)險。

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ISSN.2095-6681.2015.08.107.02

［基金課題］南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃資助項(xiàng)目（編號：201003044C-6）