楊 柳，汪小菀，王冰瑜，宋潤(rùn)敏，李 江

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130024）

hZimp10是一種新的激活STAT的蛋白抑制劑 （protein inhibitor of activated STAT，PIAS）類(lèi)似蛋白［1］。hZimp10全長(zhǎng)定位于人類(lèi)第10號(hào)染色體上，hZimp10和其他PIAS蛋白一樣具有 Miz結(jié)構(gòu)域［2－3］，且與其他PIAS蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)相比，hZimp10具有高度的的相似性，因此研究者將這一蛋白定義成在人類(lèi)10號(hào)染色體上包含鋅指結(jié)構(gòu)的Miz1的PIAS類(lèi)似蛋白 （hZimp10）。有研究［4］表明：hZimp10選擇性地表達(dá)在人類(lèi)的卵巢、睪丸和前列腺組織中。作為一種新的PIAS類(lèi)似蛋白，hZimp10已經(jīng)被證明是雄激素受體 （androgen receptor，AR）的共激活因子，與AR協(xié)同作用于AR信號(hào)通路［4］。有研究［5－6］表明：hZimp10 可 增強(qiáng)Smad3／Smad4蛋白復(fù)合物和P53等的轉(zhuǎn)錄活性。

目前對(duì)于hZimp10是否參與腫瘤的抑制作用，是否能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，及其與生殖系統(tǒng)功能的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。而研究一種新的蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，抗體是最有力的工具之一。本研究將人hZimp10－N128基因插入 pGEX－4T－1中構(gòu)建pGEX－4T－1－h(huán)Zimp10重組表達(dá)載體，獲得了大量的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白，利用純化GST－h(huán)Zimp10融合蛋白免疫實(shí)驗(yàn)用兔，制備hZimp10蛋白高效價(jià)抗體。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、主要試劑和儀器 人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DU145、大腸桿菌DH5α（克隆宿主）、BL21（表達(dá)宿主）和pGEX－4T－1由東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所提供。新西蘭大白兔購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。T4 DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒為美國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品，低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白Marker購(gòu)自上海生物工程有限公司，IPTG購(gòu)自華美生物工程公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，谷胱甘肽Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司，弗氏佐劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

PCR儀 （杭州博日科技有限公司），96孔板（美國(guó)Corning Costar公司），F(xiàn)LUOstar Optima型多功能酶標(biāo)儀 （德國(guó)BMG Technology公司），離心機(jī) （韓國(guó)DAIHAN公司），超聲波細(xì)胞粉碎儀 （寧波新芝生物科技股份有限公司），細(xì)菌搖床（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2 PCR－PMD18－T／hZimp10重組質(zhì)粒的構(gòu)建從GenBank獲得hZimp10基因全長(zhǎng)，基因序列號(hào)為 AY235683。以pcCDNA3.1－Flag－h(huán)Zimp10為模板，上游引物P1：5′－GGATCCATGAATTCTATG GACAGG（下劃線部分為BamHⅠ和EcoRⅠ酶 切位點(diǎn)）；下游引物P2：5′－CTCGAGAGGGGG CTGCAT GGGGAG （下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。應(yīng)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR瓊脂凝膠電泳回收擴(kuò)增的片段，與PMD18－T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含Amp＋瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切鑒定。

1.3 原核表達(dá)載體pGEX－4T－1的構(gòu)建 將含有hZimp10基 因 N－128片段的pMD18－T質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切后 （片段長(zhǎng)度約400bp），利用回收試劑盒獲得hZimp10基因該區(qū)片段，同時(shí)利用相同的酶處理質(zhì)粒pGEX－4T－1（約4900bp）。然后將回收的hZimp10基因N－128片段和經(jīng)酶切的載體pGEX－4T－1在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過(guò)夜。選擇酶切鑒定確認(rèn)重組成功的質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 GST－h(huán)Zimp10融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組質(zhì)粒PGEX－4T－1／hZimp10 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB／Ampr培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將培養(yǎng)物按1∶50的比例轉(zhuǎn)接于含Amp＋的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。在培養(yǎng)液的A600為0.5～0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.08mmol·L－1，不加入IPTG者為陰性對(duì)照，置25℃繼續(xù)培養(yǎng)4～5h。離心收集菌體，以SDS－PAGE進(jìn)行鑒定GST－h(huán)Zimp10融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。以5000r·min－1于4℃離心5min，收集菌體，用60mL冰預(yù)冷的NETN懸浮1L菌液的沉淀。用超聲裂解細(xì)菌，再以9600r·min－1、于4℃離心15min，取上清，過(guò)Glutathione－Sepharose 4B柱，先以等體積洗脫緩沖液1（含 20mmol·L－1谷胱甘肽、50mmol·L－1Triscl，pH ＝8.0）洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2（含100mmol·L－1谷胱甘肽）洗2次，收集洗脫液，SDS－PAGE鑒定純化產(chǎn)物。結(jié)果對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量大小，并以條帶強(qiáng)弱顯示。

1.5 兔抗hZimp10抗血清的制備 以純化的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清作為免疫前的血清對(duì)照。2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，500μg純化的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2周加強(qiáng)免疫1次。于末次免疫后1周取耳血，用ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1∶100000時(shí)，頸動(dòng)脈放血，收集血清。

1.6 ProteinA／G純化抗hZimp10血清 將ProteinA／G sepharose CL－4B填料緩慢裝柱，平衡柱子后加入經(jīng)過(guò)稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結(jié)合，即親和層析使抗體結(jié)合在柱子上，經(jīng)TBS洗滌2次后，加pH 2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測(cè)定各收集管的280nm處A值，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用SDS－PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。結(jié)果以條帶強(qiáng)弱表示。

1.7 GST－h(huán)Zimp10抗體效價(jià)的測(cè)定 將GST－h(huán)Zimp10融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對(duì)照，將純化后的GST－h(huán)Zimp10抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后，采用間接ELISA［7］測(cè)定抗體的效價(jià)。在酶標(biāo)儀上分別測(cè)492和620nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值?？贵w效價(jià)＝ （A492－A空白孔）／A620。

1.8 GST－h(huán)Zimp10抗體應(yīng)用于細(xì)胞中hZimp10蛋白的檢測(cè) 收集培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞LNCaP和DU145，裂解超聲后用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，之后將樣品等蛋白量進(jìn)行SDSPAGE，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂奶粉封閉1h，依次滴加兔抗hZimp10抗體 （室溫2h、PBS洗3次）及山羊抗兔IgG2HRP（室溫反應(yīng)1h、PBS洗滌3次），最后加底物DAB顯色，并拍照，結(jié)果以蛋白表達(dá)強(qiáng)度表示。

2 結(jié) 果

2.1 hZimp10 基因 N－128 片段 PCR 擴(kuò)增hZimp10基因N－128編碼128個(gè)氨基酸，其編碼區(qū)域共384bp。應(yīng)用PCR技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)引物P1／P2，從模板 pcCDNA3.1－Flag－h(huán)Zimp10 擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為384bp的片段，與預(yù)期長(zhǎng)度相符?；厥掌?，瓊脂凝膠電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增出的hZimp10－N－128片段DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoregram of hZimp10N－128 DNA amplified by PCR

2.2 重組質(zhì)粒pGEX－4T－1／－h(huán)Zimp10鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切后，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果分別得到約為4900和400bp的2個(gè)條帶（圖2和3），與測(cè)序結(jié)果 （圖4）一致。驗(yàn)證重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－h(huán)Zimp10構(gòu)建正確。

圖2 雙酶切質(zhì)粒pGEX－4T－1（BamHⅠ／XhoⅠ）瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoregram of plasmid pGEX－4T－1 digested by BamHⅠ／XhoⅠ

圖3 重組質(zhì)粒 pGEX－4T－1／hZimp10的雙酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoregram of identification of recombinant plasmid pGEX－4T－1／hZimp10digested by BamHⅠ／XhoⅠ

圖4 重組質(zhì)粒 pGEX－4T－1／hZimp10的測(cè)序結(jié)果Fig.4 Results of sequencing of recombinant plasmid pGEX－4T－1／hZimp10

2.3 GST－h(huán)Zimp10融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGEX－4T－1／hZimp10轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)LB培養(yǎng)后使用IPTG誘導(dǎo)，收集細(xì)菌裂解液，利用親和層析技術(shù)，與谷胱甘肽－瓊脂糖凝膠4B結(jié)合，通過(guò)多次洗脫純化，獲得GST－h(huán)Zimp10融合蛋白和對(duì)照GST蛋白，經(jīng)SDS－PAGE分析 （圖5），經(jīng) Glutathione－Sepharose－4B 層 析 法 純 化 后，獲得相對(duì)分子質(zhì)量約為40000的特異的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白，與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量相符。

2.4 GST－h(huán)Zimp10抗體效價(jià) 將免疫前的新西蘭大白兔血清作為對(duì)照，取末次加強(qiáng)免疫后第7天的血清，將GST－h(huán)Zimp10抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后，采用間接ELISA測(cè)定GST－h(huán)Zimp10抗體效價(jià)。免疫前的兔血清未測(cè)出抗融合蛋白GST－h(huán)Zimp10的抗體，GST－h(huán)Zimp10抗體的滴度高達(dá)1∶100000以上。見(jiàn)圖6。

圖5 純化的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoregram of SDS－PAGE analysis of purified GST－h(huán)Zimp10fusion protein

圖6 間接ELISA法測(cè)定GST－h(huán)Zimp10抗體的效價(jià)Fig.6 Titers of GST－h(huán)Zimp10antibody detected by indirect ELISA assay

2.5 ProteinA／G純化抗hZimp10血清 為了提高制備抗體的純度，利用ProteinA／G純化抗hZimp10血清。染色結(jié)果顯示：與純化前比較，本研究純化后的樣品有清晰的輕、重鏈帶，并且無(wú)明顯其他條帶。見(jiàn)圖7。

2.6 GST－h(huán)Zimp10抗體血清特異性的 Western blotting鑒定 有研究［4］證明：hZimp10能夠與AR協(xié)同作用于AR信號(hào)通路，使hZimp10在LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平增高，在DU145細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性缺失。因此本文作者將GST－h(huán)Zimp10抗體應(yīng)用于LNCaP細(xì)胞株和DU145細(xì)胞株中進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。制備的hZimp10抗體與LNCaP細(xì)胞株中所表達(dá)的hZimp10蛋白發(fā)生了抗原－抗體反應(yīng)，在Marker指示的123000處出現(xiàn)了1條特異的蛋白帶，在DU145細(xì)胞株中未見(jiàn)特異蛋白條帶，證明LNCaP細(xì)胞高表達(dá)hZimp10，驗(yàn)證了GST－h(huán)Zimp10抗體在LNCaP細(xì)胞中具有特異性。見(jiàn)圖8。

圖7 ProteinA／G純化后的hZimp10抗體SDS－PAGE分析電泳圖Fig.7 Electrophoregram of SDS－PAGE analysis of purified hZimp10antibody by Protein A／G

圖8 Western blotting法檢測(cè)hZimp10在LNCaP和DU145細(xì)胞中表達(dá)電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of hZimp10protein in LNCaP and DU145cells detected by Western blotting method

3 討 論

近年來(lái)，人們對(duì)PIAS蛋白的研究取得了很大的進(jìn)展，有研究［8－9］表明：PIAS蛋白對(duì)一些抑癌基因如P53、Smad的轉(zhuǎn)錄活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者［10］認(rèn)為：PIAS蛋白在前列腺癌早期診斷中有潛在價(jià)值，PIAS在其他疾病中的潛在功能也相繼被報(bào)道［11－13］。雖然hZimp10作為一種新的PIAS類(lèi)似蛋白和其他PIAS蛋白一樣可以與一些蛋白相結(jié)合，例如：P53和AR，但其很可能是通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白的功能［14］。因此，探究hZimp10蛋白在癌細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤惡性程度的相關(guān)性可能成為生物領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

研究一種新的蛋白質(zhì)的功能，高效價(jià)的特異性抗體是最有力的工具之一。廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和功能研究中的免疫組織化學(xué)、免疫印跡和免疫沉淀等一系列技術(shù)均是基于抗原－抗體相互作用發(fā)展起來(lái)的。而在抗體制備過(guò)程中，抗體特異性最重要的影響因素之一是抗原的質(zhì)量［15］。本研究利用特殊序列 （hZimp10蛋白N端128個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)DNA片段）構(gòu)建GST－h(huán)Zimp10融合蛋白原核表達(dá)載體，所獲蛋白用Glutathione－Sepharose 4B柱純化，得到高效表達(dá)特異性的GST－h(huán)Zimp10融合蛋白。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭兔獲得抗GST－h(huán)Zimp10融合蛋白的高效價(jià)抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果表明抗體效價(jià)高達(dá)1∶100000以上。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明：在LNCaP細(xì)胞中可檢測(cè)到大小為123000的hZimp10特異性條帶，而在DU145細(xì)胞中未檢測(cè)到，此結(jié)果與文獻(xiàn)［4］報(bào)道的結(jié)果一致。因此，該抗體可應(yīng)用于細(xì)胞中hZimp10蛋白的檢測(cè)并能有效檢出hZimp10蛋白在不同細(xì)胞株中的差異表達(dá)，并可用于進(jìn)一步探討hZimp10蛋白與前列腺癌的相關(guān)性。

綜上所述，本文作者成功地制備了高效價(jià)、高特異性的hZimp10多克隆抗體，為進(jìn)一步探究hZimp10蛋白在癌細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤惡性程度的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)，為系統(tǒng)研究hZimp10蛋白功能及其在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的作用機(jī)制提供了重要的工具。

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