魯 琰 李 偉 朱明月 董 栩 陳 栘 張雪兒 李孟森，4

1.海南醫(yī)學(xué)院海南省腫瘤發(fā)生和干預(yù)重點實驗室，海南?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點實驗室，海南?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院13卓越創(chuàng)新班，海南?？?571199；4.海南醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，海南海口 570102

乙肝病毒X基因?qū)Ω伟〣el7402細(xì)胞ras基因表達(dá)的影響

魯 琰1，2李 偉1，2朱明月1，2董 栩1，2陳 栘1，2張雪兒3李孟森1，2，4

1.海南醫(yī)學(xué)院海南省腫瘤發(fā)生和干預(yù)重點實驗室，海南海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點實驗室，海南?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院13卓越創(chuàng)新班，海南?？?571199；4.海南醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，海南?？?570102

目的探討乙肝病毒X基因（HBx）對人肝癌細(xì)胞原癌基因ras表達(dá)水平的影響。方法將pcDNA3.1載體與HBx基因連接構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Bel7402，以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的Bel7402細(xì)胞為對照，于轉(zhuǎn)染后2、4、8、16 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并用Western blot技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)n-Ras蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的Bel7402對照組相比，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx的Bel7402細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)水平在第2小時明顯降低，第4小時Ras蛋白的表達(dá)水平仍有降低趨勢，但比第2小時表達(dá)量有所增加；第8小時和第16小時，Ras蛋白的表達(dá)水平與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。 結(jié)論HBx對人肝癌Bel7402細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)有明顯影響，HBx持續(xù)表達(dá)可能對Ras表達(dá)有促進(jìn)作用。

肝癌；乙肝病毒X基因；Ras

肝癌（HCC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，50%以上的肝癌患者分布在中國內(nèi)地[1]，肝癌已經(jīng)成為我國嚴(yán)重的健康問題。HBV感染是促進(jìn)肝癌形成的主要誘因，其相關(guān)性高達(dá)80%[2]。近年來研究顯示，作為乙肝病毒X基因的表達(dá)產(chǎn)物（HBx）具有廣泛的反式激活功能，其能通過直接或間接的蛋白質(zhì)間相互作用參與感染肝細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等過程，在肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。

惡性腫瘤的形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移與癌基因、抑癌基因不可逆的積累突變和失調(diào)有關(guān)，其中，ras基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系引起人們較高的關(guān)注。有研究表明，ras在肝癌早期已有表達(dá)，ras與其他基因如c-myc基因的協(xié)同作用在肝細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。Ras蛋白所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是目前研究肝癌發(fā)生的熱點問題。Ras蛋白在肝癌旁組織的表達(dá)顯著高于HCC組織的表達(dá)，并認(rèn)為Ras蛋白表達(dá)陽性的肝細(xì)胞具有癌變的潛能。

顧健人等[7]曾證實，n-Ras在肝癌中會過量表達(dá)，而蛋白的異常過量表達(dá)可能正是腫瘤發(fā)生的重要原因。但是，在HBV相關(guān)的肝癌中n-Ras表達(dá)是否異常，HBx對肝癌細(xì)胞中n-Ras的表達(dá)是否有影響以及其機(jī)制目前還未見相關(guān)報道，所以，本實驗試圖將HBx基因轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后的不同時間點連續(xù)檢測n-Ras蛋白的表達(dá)量。通過不同時間點n-Ras蛋白表達(dá)量的變化來探討HBx對Ras蛋白表達(dá)的影響。為進(jìn)一步研究HBx對肝細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及肝細(xì)胞癌的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移程度奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞系Bel7402購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；特異性鼠抗人n-Ras抗體購于美國Calbiochem公司；HBx抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體和馬抗小鼠的IgG抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞Bel7402培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2一定飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。轉(zhuǎn)染前24 h，用胰酶消化以便收獲對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔4.0×105個細(xì)胞接種于6孔板，37℃5% CO2及一定飽和濕度下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染。

1.2.2 載體構(gòu)建及瞬時轉(zhuǎn)染 設(shè)計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，擴(kuò)增長度為482 bp的HBx基因片段，經(jīng)酶切和連接反應(yīng)將HBx片段插入pcDNA3.1載體中，構(gòu)建重組載體pcDNA3.1-HBx；試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切后電泳鑒定并測序；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-HBx瞬時轉(zhuǎn)染Bel7402。

1.2.3 細(xì)胞總蛋白提取 分別用磷酸鹽緩沖液漂洗并收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2、4、8、16 h的細(xì)胞，3000 r/min離心5 min，棄上清，加入30 μL細(xì)胞裂解液及0.3 μL PMSF，冰上靜置裂解30 min，12 000 r/min離心10 min收集上清，用改良的Bradford法進(jìn)行蛋白定量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot技術(shù)檢測蛋白表達(dá)水平的變化

根據(jù)蛋白濃度每孔上樣36 μg蛋白，加入上樣緩沖液煮沸5 min。上樣至15%的SDS-PAGE凝膠中，80 V電泳30 min后，120 V電泳60 min。取出凝膠，于轉(zhuǎn)印液中平衡30 min。4℃40 V轉(zhuǎn)印3 h至PVDF膜。取出PVDF膜，1×PBS漂洗5 min，室溫封閉2 h。應(yīng)用特異性抗體HBx（1∶1000稀釋，Abcam，USA）、n-Ras（1∶1000稀釋，Calbiochem，USA）和β-actin（1∶1000稀釋，Santa Cruz，USA）為一抗4℃雜交過夜。用1×PBST漂洗3次，再加入馬抗小鼠的IgG抗體（1∶2000稀釋，Santa Cruz，USA）為二抗，雜交2 h。應(yīng)用DAB顯色法顯色并掃描成像。以β-actin為內(nèi)對照，比較轉(zhuǎn)染HBx后培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞中HBx和n-Ras蛋白表達(dá)水平的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)軟件Graph Pad Prism 5處理，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶切鑒定結(jié)果

插入HBx基因的pcDNA3.1-HBx重組表達(dá)載體，如圖1所示，設(shè)計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，擴(kuò)增長度為482 bp的HBx基因片段，經(jīng)酶切和連接反應(yīng)將HBx片段插入pcDNA3.1載體中，構(gòu)建重組載體pcDNA3.1-HBx；雙酶切后電泳鑒定，如圖2所示，pcDNA3.1-HBx經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，電泳檢測出現(xiàn)482 bp的HBx片段，說明構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體后HBx在Bel7402細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，Bel7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體后從轉(zhuǎn)染的第2小時開始有HBx蛋白表達(dá)，且蛋白表達(dá)量隨時間遞增（圖3），而轉(zhuǎn)染空載體的對照組中未見HBx表達(dá)。說明pcDNA3.1-HBx載體成功轉(zhuǎn)染到Bel7402細(xì)胞中，并且目的基因HBx在細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.3 Western blot檢測Ras蛋白的表達(dá)水平變化

應(yīng)用Western blot技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)參，檢測轉(zhuǎn)染HBx重組載體和對照空載體后，細(xì)胞中Ras蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果如圖4所示，在對照組中Ras蛋白的相對表達(dá)量在轉(zhuǎn)染空載體后的第2、4、8、16小時分別為（3.9±0.2）、（4.9±0.2）、（4.6±0.3）和（4.9± 0.2），在轉(zhuǎn)染空載體后的第2小時Ras蛋白的相對表達(dá)量有所下降，但是4 h后Ras蛋白的表達(dá)幾乎無變化（P＞0.05）。在肝癌細(xì)胞Bel7402中轉(zhuǎn)染乙肝病毒HBx基因后Ras蛋白在不同時間點表達(dá)量明顯不同。第2小時轉(zhuǎn)染組Ras蛋白的相對表達(dá)量為（1.9±0.2），而對照組為（3.9±0.2）；第4小時轉(zhuǎn)染組Ras蛋白的相對表達(dá)量為（3.5±0.18），雖然與第2小時相比，表達(dá)量明顯增加，但是仍然低于對照組，這說明轉(zhuǎn)染HBx后Ras蛋白的表達(dá)量在初期是降低的；然而到了第8小時和第16小時，轉(zhuǎn)染組Ras蛋白的相對表達(dá)量分別為（8.2±0.2）和（8.2±0.2），對照組的相對表達(dá)量分別為（4.6±0.3）和（4.9±0.2），所以從轉(zhuǎn)染HBx的第8小時開始Ras蛋白表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），見圖4，說明在第8、16小時HBx可能誘導(dǎo)Ras蛋白表達(dá)增加。

圖1 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)模式圖

圖2 構(gòu)建的載體酶切鑒定圖

圖3 HBx在Bel7402中的表達(dá)

3 討論

圖4 不同時間點Ras蛋白的表達(dá)水平

肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的多階段、多因素、多基因參與的過程[8-9]。HBVx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物X蛋白是病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在體外細(xì)胞培養(yǎng)時能夠控制和調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)，干擾宿主細(xì)胞生長代謝，影響細(xì)胞基因的正常表達(dá)而誘發(fā)原發(fā)性肝癌[10-12]。因此，HBx基因可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。

ras基因是第一個被鑒定的人類原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物Ras蛋白是一類重要的功能蛋白，其能通過與GDP和GTP結(jié)合并水解GTP完成對正常細(xì)胞生長信號的傳遞和調(diào)節(jié)功能[13]，介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子和多種細(xì)胞外信號的信息通路，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。Ras蛋白能通過一系列途徑將生長因子的信號帶入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。所以Ras蛋白表達(dá)量的異常升高，是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，ras基因活化后能使鼠NIH/3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，Ras蛋白與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系非常密切[16]。紀(jì)子釗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Ras蛋白在肝癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織的表達(dá)，且與VEGF、P53等協(xié)同表達(dá)，與肝細(xì)胞癌的惡性程度、侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。最近Oishi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HBx能夠通過與Ras的協(xié)同作用來抑制Ras蛋白誘導(dǎo)的衰老，但是具體機(jī)制還不明確。

為了研究HBx對肝細(xì)胞癌變過程中Ras蛋白表達(dá)水平的影響，本研究將重組的HBx載體pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Bel7402，提取蛋白后應(yīng)用Western blot技術(shù)來檢測Ras蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞Bel7402轉(zhuǎn)入HBx基因后的不同時間點，Ras蛋白表達(dá)量明顯不同。在轉(zhuǎn)染后4 h，與對照相比，轉(zhuǎn)染HBx的細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)量有逐步上升的趨勢；在剛轉(zhuǎn)染的2 h內(nèi)，Ras表達(dá)有下降現(xiàn)象，這可能是由于在轉(zhuǎn)染時，pcDNA3.1-HBx載體以及轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定損傷作用，這個作用可能誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致Ras蛋白的表達(dá)量下降，而不是HBx本身的抑制作用。在轉(zhuǎn)染8、16 h后，細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HBx，這時HBx開始發(fā)揮對Ras基因表達(dá)的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染HBx能促進(jìn)人肝癌Bel7402細(xì)胞的Ras蛋白表達(dá)，提示在轉(zhuǎn)染HBx第4小時Ras蛋白的表達(dá)量開始升高。

Ras在肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而肝癌的發(fā)生與感染HBV密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中也能誘導(dǎo)Ras和其他癌基因的表達(dá)從而促進(jìn)肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和行為[19-20]。本研究結(jié)果提示，HBx可能通過其反式作用因子的轉(zhuǎn)錄激活作用上調(diào)Ras蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致生長因子或其他信號傳遞異常，致使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，這可能是乙肝病毒誘導(dǎo)肝癌的發(fā)病機(jī)制之一。由于Ras蛋白能激動生長信號的轉(zhuǎn)遞，是細(xì)胞生長和惡變的重要信息物質(zhì)，所以實驗結(jié)果提示HBx可能通過誘導(dǎo)Ras表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。HBx通過何種機(jī)制誘導(dǎo)Ras表達(dá)目前還不清楚，這是有待進(jìn)一步研究的科學(xué)問題，也是探索HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵機(jī)制。

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The effect of hepatitis B virus X gene on the expression of ras in human hepatoma cells Bel7402

LU Yan1,2LI Wei1,2ZHU Mingyue1,2DONG Xu1,2CHEN Yi1,2ZHANG Xue'er3LI Mengsen1,2,4

1.Hainan Provincial Key Laboratory of Carcinnogenesis and Intervention,Hainan Medical College,Hainan Province, Haikou 571199,China;2.Key Laboratory of Molecular Biology,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 571199,China;3.The Class 13 Innovation Excellence,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 571199, China;4.Institution of Tumor,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 570102,China

Objective To investigate the influence of HBx on proto-oncogene ras expression in human hepatoma cells. Methods HBx linked to pcDNA3.1 for constructing eukaryotic expression vector pcDNA3.1-HBx.pcDNA3.1-HBx vectors were transfected into Bel7402 cells to establish Bel7402/HBx cell model.Bel7402 cells transfected with pcDNA3.1 was used as control.Western blot was applied to evaluate the expression levels of n-Ras in Bel7402 cell while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 2,4,8,16 h.Results The expression of Ras in Bel7402 was significantly lower while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 2 h and 4 h contrast with control group (vehicle vector),however,the expression of Ras was significantly promoted while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 8 h and 16 h（P＜0.05）.Conclusion HBx plays a role in influencing the expression of Ras in Bel7402 cells.Persistent expression of HBx maybe stimulate expression of Ras in hepatoma cells.

Hepatocellular carcinoma;HBx;Ras

R734

A

1673-7210(2015)11(b)-0009-04

2015-06-16本文編輯：程 銘）

國家自然科學(xué)基金（81360307、81260306、81160261、31060164）；海南省社會發(fā)展科技專項（2015SF03）；海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金（HY2013-19）；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（HYCX2014031）。

李孟森（1970-），男，研究員，主要從事腫瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及腫瘤耐藥機(jī)制研究。