朱晨芳 聶 鑫 何 柳 楊 志 顧 巖

Sulf2促進淋巴管生成的實驗研究

朱晨芳 聶 鑫 何 柳 楊 志 顧 巖

目的研究硫酸酯酶2（Heparan sulfate 2，Sulf2）在淋巴管生成中的作用。方法根據(jù)Sulf2 cDNA序列，設(shè)計并構(gòu)建pCDH-Flag-Sulf2真核表達載體，慢病毒轉(zhuǎn)染293FT細胞，獲得合成純化的rSulf2。通過流式分析、成管試驗、裸鼠耳部淋巴管生成模型等實驗，研究rSulf2對于淋巴管內(nèi)皮細胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）細胞周期、凋亡、成管能力和淋巴管生成的影響。結(jié)果構(gòu)建的pCDH-Flag-Sulf2真核表達載體，經(jīng)酶切和測序證明構(gòu)建完全正確。Western blot檢測證明293FT細胞轉(zhuǎn)染pCDH-Flag-Sulf2真核表達載體后，rSulf2表達增高。合成純化的rSulf2可以減少無血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)的LECs細胞的凋亡，增加活細胞的比例，但對細胞周期無顯著影響，rSulf2還可以增加淋巴管內(nèi)皮細胞的體外成管能力及增加裸鼠耳部淋巴管的數(shù)量。結(jié)論Sulf2可以抑制LECs細胞的凋亡，對淋巴管生成起到促進作用。

硫酸酯酶2淋巴管內(nèi)皮細胞淋巴管生成

淋巴系統(tǒng)是維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，引流身體組織液、體液，發(fā)揮免疫功能的主要脈管系統(tǒng)。淋巴管的功能主要依靠LECs細胞的功能來維持。淋巴管生成（L ymphangiogenesis）指在已經(jīng)存在淋巴管的基礎(chǔ)上出現(xiàn)淋巴管的新生。新生淋巴管僅由單層淋巴內(nèi)皮細胞組成，基底膜不完整、管壁薄、內(nèi)皮細胞間缺乏緊密連接[1]，在炎癥及腫瘤過程中，具有重要的組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移作用[2-3]。淋巴管生成是研究淋巴管疾病，如淋巴管畸形、淋巴水腫、淋巴脈管瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的重點。因此，了解調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細胞功能的分子機制對研究淋巴管生成具有重要意義。

Sulf2是Sulfs家族成員，Sulfs家族包括Sulf1和Sulf2兩個結(jié)構(gòu)類似，功能不完全相同的內(nèi)源性硫酸酯酶[4]。Sulf2可通過去除細胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan sulfate proteoglycan，HSPGs）上N-3-O和6-O上的硫酸氨基葡萄糖硫酸化，來影響HSPGs、配體和受體三元復(fù)合物的形成，Sulfs是調(diào)節(jié)配基-受體后續(xù)信號通路活性的關(guān)鍵分子[5-6]。Sulf2可改變具有肝素結(jié)合能力的生長因子，如VEGF、b-FGF等的生物學(xué)活性[7-8]。Sulf2通過增強其與肝素的結(jié)合能力，促進血管內(nèi)皮細胞的功能。目前研究主要集中在Sulf2與VEGF功能調(diào)節(jié)和血管生成方面，本研究主要探索Sulf2在淋巴管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞293FT為本實驗室自存；人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞HDLEC（PromoCell，德國）。HDLEC細胞分組包括①對照組：內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基MV2進行細胞培養(yǎng)；②rSulf2組：含有終濃度為50 ng/mL rSulf2的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基MV2進行細胞培養(yǎng)。

胎牛血清（Gibco，美國），高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國），內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基MV2組合（PromoCell，德國），限制性內(nèi)切酶Nhe I、BamH I和T4連接酶（MBI，美國），脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），Transwell小室（Corning Costar，美國），matrigel（BD Biosciences，美國），VEGF-D（Pe-Protech，美國），一抗Rabbit-anti-mouse-LYVE-1（Angiobio，美國)，二抗Goat-ant-rabbbit-HPR（Abcam，美國），其他試劑為分析純試劑。

rSulf2合成純化后，-20℃分裝保存。細胞培養(yǎng)時調(diào)整其在培養(yǎng)液中的終濃度為50 ng/mL；注射裸鼠時用生理鹽水調(diào)整rSulf2濃度為1.5 mg/mL。

實驗動物為BALB/c-nu裸鼠，雌雄不限，4周齡，體質(zhì)量14～15 g（中科院上海實驗動物中心）。飼養(yǎng)于恒溫（25～27℃）、恒濕（45%～50%），符合SPF條件的裸鼠室內(nèi)。籠具、墊料、飲用水和食料均經(jīng)滅菌處理，按標準方式給予自由活動與進食。①對照組：3只裸鼠雙側(cè)耳根部每天注射0.1 mL生理鹽水；②rSulf2組：3只裸鼠雙側(cè)耳根部每天注射0.1 mL rSulf2。

pCDH過表達載體（上海肺科醫(yī)院實驗室贈送）是目前最有效的過表達載體之一，通過將外源性基因整合到細胞基因組實現(xiàn)穩(wěn)定表達（圖1）。

圖1 pCDH表達載體結(jié)構(gòu)說明Fig.1 pCDH expression vector structure

1.2 方法

1.2.1 Flag-Sulf2融合蛋白真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

去除Sulf2基因的信號肽序列，通過三輪PCR反應(yīng)添加Flag標簽和Ig-k鏈的信號肽序列。Flag-Sulf2上游引物①Flag-Sulf2 F1：5’-GACGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGTTCTGGCTTCC；②Flag-Sulf2 F2：5’－TGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT G ACGATTACAAGGATGACGACG-3’；③Flag-Sulf2 F3（Nhe I）：5’-CTAGCTAGCATGGAG ACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGG -3’。下游引物5’-CGGGATCCTTAACCTTCCCAGCCTTCCC-3’進行PCR反應(yīng)，獲得Flag-Sulf2 CDS區(qū)DNA片段；Flag-Sulf2的序列結(jié)構(gòu)：信號肽部分，F(xiàn)lag部分，F(xiàn)lag和Sulf2之間加了GSG三個氨基酸的Linker部分，Sulf2成熟蛋白開始部分，及信號肽的切割位點（表1）；PCR產(chǎn)物及pCDH載體用NheI和BamHI進行酶切，電泳后行膠回收，連接PCR產(chǎn)物與pCDH載體。載體連接后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細菌、挑克隆、擴增、酶切鑒定構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pCDH-Flag-Sulf2；構(gòu)建成功后，將酶切證實正確的質(zhì)粒送至測序公司（上海美吉公司），經(jīng)自動基因測序儀測序。

Flag cDNA序列：ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACTGGT GACGATTACA AGGATGACGA CGATAAGGGT TCTGGCttcctgtc gcaccaccgc……（Sulf2全長序列，略）。

1.2.2 Flag-Sulf2慢病毒表達載體的包裝

慢病毒在293FT細胞中進行包裝，將1×106個處于對數(shù)生長期的293FT細胞傳代至10 cm2的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293FT細胞，操作步驟按照說明書進行。慢病毒體系：40 μL的Lipofectamine 2000和250 μL的opti-MEM培養(yǎng)基，孵育5 min；將10 μg的pCDH-Flag-Sulf2，7.5 μg的pSPAX2，3 μg的pMD2.G和250 μL的optiMEM培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，再加入Lipofectamine 2000，孵育20 min后，加到293FT細胞中。

表1 Flag-Sulf2的序列結(jié)構(gòu)Table 1 Sequence of Flag-Sulf2

1.2.3 Western blot檢測293FT細胞中Sulf2的表達

293FT細胞蛋白質(zhì)的抽提和定量按照說明書操作步驟進行。每孔配制含50 μg總蛋白樣的樣品液，煮沸3 min。80 V電泳至染料剛出膠底部。Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移儀在200 mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)膜2 h。膜在5%BSA溶液中室溫孵育1 h，以封閉膜上的非特異結(jié)合，在封閉過的膜上加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜3次。加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次。膜置于化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)液中室溫孵育3 min，X光膠片曝光，Bio-Rad凝膠成像儀拍照。

1.2.4 Flag-Sulf2（rSulf2）的收集及純化

慢病毒載體感染293FT細胞48 h后加入含有1 μg/m L嘌呤霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液進行篩選，篩選得穩(wěn)定表達Flag-Sulf2的293FT細胞（293FT-Flag-Sulf2）。收集含有Flag-Sulf2的細胞培養(yǎng)上清，加入anti-Flag/M2 agarose beads 4℃搖床孵育過夜，加入0.1 mg/mL Flag肽（DYKDDDDK）洗脫，洗脫液用超濾管超濾置換成50 mM HEPES（pH 8.0）溶解。BCA蛋白定量試劑盒測定Flag-Sulf2（rSulf2）的濃度。

1.2.5 細胞周期實驗

各組細胞70%融合時，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集，制成單細胞懸液并計數(shù)；將每組2×106個單細胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇，-20℃固定過夜；加入20 μg/mL RNase A 500 μL，PBS中37℃孵育30 min；加入500 μL PI染液，混勻后室溫避光孵育30 min；再次混勻后過300 μm篩網(wǎng)，用流式細胞儀檢測細胞周期狀況。分析比較各細胞周期的比例，計算細胞增殖指數(shù)（Proliferation index，PI），PI=（S期細胞+G2期細胞）/（G1期細胞+S期細胞+G2期細胞）×100%。

1.2.6 細胞凋亡實驗

提前2 d將細胞鋪至6孔板，當(dāng)70%融合時，用無血清培養(yǎng)液處理各組細胞24 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集，制成單細胞懸液；1 500 r/min離心5 min，收集1～5×105細胞，加入100 μL 1× Annexin V結(jié)合緩沖液重懸，加1 μL Annexin V室溫避光染色15 min，加入1 μL PI，1 min后流式細胞儀檢測。

1.2.7 成管實驗

Matrigel 4℃融化，用培養(yǎng)基1∶1稀釋。24孔板每孔中加入100 μL Matrigel，放入培養(yǎng)箱中30 min使膠凝固。在膠凝固的過程中，開始準備淋巴管內(nèi)皮細胞懸液，細胞消化后調(diào)整濃度到5×105cells/mL，每孔加入1 mL細胞懸液，24 h后100倍光鏡下拍照。

1.2.8 裸鼠耳部淋巴管生成模型的建立

每天上午10點于裸鼠耳根部背側(cè)皮下分別注射生理鹽水或rSulf2，注射后的裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，連續(xù)注射6周后處死裸鼠，切取雙側(cè)耳朵，4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋。

1.2.9 免疫組化

石蠟切片行脫蠟，抗原修復(fù)。加入標記淋巴管內(nèi)皮細胞的一抗LYVE-1（1∶100），二抗HPR（1∶5 000）。DAB顯色及復(fù)染細胞核，脫水封片。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以x±s表示，均數(shù)比較采用非配對t檢驗或者方差分析。當(dāng)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

將構(gòu)建成功的pCDH-Flag-Sulf2重組質(zhì)粒進行酶切后電泳檢測，發(fā)現(xiàn)原來環(huán)狀質(zhì)粒被切開，可切出一條為7 Kb的DNA大片段和2.6 Kb的DNA小片段。結(jié)果與設(shè)計序列完全相符，所含目的基因序列準確無誤，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 Sulf2重組質(zhì)粒的測序鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)測序公司（上海美吉公司）自動基因測序儀測序，證實重組質(zhì)粒編碼序列插入位置正確，無基因突變，與設(shè)計完全一致。

圖2 重組質(zhì)粒酶切后電泳圖Fig.2 Electrophoresis chart after the recombinant plasm id was digested

圖3 Western blot檢測293FT細胞中Sulf2的含量Fig.3 Sulf2 protein expression in 293 cells detected by W estern blot

2.3 Western blot檢測293FT細胞中rSulf2的表達

pCDH-Flag-Sulf2真核表達載體轉(zhuǎn)染293FT細胞后，通過Western blot檢測細胞中Sulf2的表達量。與對照組相比，293FT細胞中Sulf2蛋白表達顯著上升，條帶濃聚，其灰度值顯著上升（125.61±0.55 vs 24.18±0.21，P＜0.01）。提示pCDH-Flag-Sulf2真核表達載體可顯著提高Sulf2的表達（圖3）。

2.4 細胞周期實驗

與對照組相比，rSulf2組G1期細胞減少（73.15±1.20 vs 77.6±0.57，P＞0.05），G2/M期細胞增多（17.65±1.76 vs 15.09±0.72，P＞0.05），PI增加（27.15±0.53 vs 22.49±0.49，P＞0.05），但是差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，提示rSulf2雖然對淋巴管內(nèi)皮細胞的細胞周期有促進作用，但是作用效果不明顯（圖4）。

圖4 流式細胞儀檢測淋巴管內(nèi)皮細胞的細胞周期Fig.4 The cell cycle of lym phatic endothelial cells detected by flow cytometry

圖5 流式細胞儀檢測淋巴管內(nèi)皮細胞的凋亡情況Fig.5 Apoptosis of lymphatic endothelial cells detected by flow cytometry

2.5 細胞凋亡實驗

無血清培養(yǎng)液處理細胞24 h，淋巴管內(nèi)皮細胞中漂浮細胞顯著增加。rSulf2組與對照組相比較，早期凋亡無差異（4.80±1.83 vs 3.65±2.05，P＞0.05），死亡細胞雖然減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異（3.27±3.49 vs 14.5±1.27，P＞0.05），晚期凋亡細胞顯著減少（4.95±2.19 vs 14.3± 1.27，P＜0.05），總凋亡率顯著降低（9.75±4.03 vs 17.95± 0.78，P＜0.05），活細胞數(shù)量增多（86.98±3.84 vs 67.60±2.12，P＜0.05）。提示rSulf2可以抑制鉑類藥物引起的淋巴管內(nèi)皮細胞的凋亡，活細胞增加，rSulf2抑制凋亡主要以抑制晚期凋亡為主（圖5）。

2.6 成管試驗

rSulf2組與對照組相比，HDLEC細胞的成管數(shù)量顯著增加，rSulf2組的成管數(shù)目與對照組相比，兩組淋巴管成管的數(shù)量差距比較大（32.41±0.62 vs 23.58±0.58，P＜0.05），提示Sulf2可顯著促進HDLEC細胞的成管能力（圖6）。

圖6 LECs成管實驗情況Fig.6 M icroscope analysis for the tube-like structure in m atrigel assay

圖7 免疫組化染色檢測裸鼠耳部淋巴管情況Fig.7 L lym phatic situation in nude m ice ear by imm unohistochem ical staining

2.7 免疫組化染色檢測裸鼠耳朵淋巴管

用LVYE-1標記裸鼠耳朵淋巴管內(nèi)皮細胞行免疫組化染色檢測。rSulf2組與對照組相比，裸鼠耳部淋巴管數(shù)量顯著增加（10±1.00 vs 1.6±0.89，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示合成純化的rSulf2對裸鼠耳部淋巴管生成具有顯著的促進作用，據(jù)此我們認為Sulf2對淋巴管生成起促進作用（圖7）。

3 討論

淋巴管因感染、腫瘤、外傷或手術(shù)等原因被破壞后，可導(dǎo)致淋巴回流障礙，從而引起各種不同程度和不同部位的淋巴水腫。淋巴水腫和淋巴管的再生障礙密切相關(guān)，是造成淋巴液滯留的主要原因。LECs是構(gòu)成淋巴管系統(tǒng)最主要的基本組成單位，因此要研究淋巴管新生的機制，就需要研究影響LECs生長和生物學(xué)行為的分子生物學(xué)機制。這些機制研究對于研究淋巴系統(tǒng)循環(huán)障礙，重塑淋巴管系統(tǒng)具有重要的意義。早期研究發(fā)現(xiàn)，一些促血管生成因子對淋巴管生成具有促進作用，這些因子包括VEGF[9-10]和b-FGF[11-12]等。研究顯示，Sulf2可以改變具有肝素結(jié)合能力的生長因子，如VEGF和b-FGF2等的生物學(xué)活性，促進它們與肝素的結(jié)合能力，推動它們促進血管內(nèi)皮細胞的功能[8]。但是，目前對于Sulfs的研究主要集中在腫瘤和血管生成方面[13-16]。

Sulfs具有不同的啟動子，Sulf2 mRNA的3’UTR序列與Sulf1啟動子不同，而且Sulf1和Sulf2在組織的分布不同，可能是其功能不同的主要因素。Sulf1可通過抑制VEGF信號通路來抑制血管生成，但Sulf2對血管生成卻起到促進作用。Sulfs具有64%的同源結(jié)構(gòu)區(qū)，這些結(jié)構(gòu)主要位于N端，所以Sulfs與生長因子的結(jié)合區(qū)域是高度統(tǒng)一的[17-18]?！皟Υ婕僭O(shè)學(xué)說”認為，生長因子配基的儲存區(qū)主要位于細胞外基質(zhì)，Sulf2可通過HSPGs與VEGF相結(jié)合[6]，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)中的生長因子的釋放，增加其生物學(xué)活性。

本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，rSulf2可以促進LECs中G1期細胞減少，G2/M期細胞增多，PI增加，但是經(jīng)過統(tǒng)計，細胞周期與對照組相比并無顯著差異。研究顯示，Sulf2雖然對LECs的細胞周期有促進作用，但是作用效果并不顯著，可能和其不是直接作用于細胞周期相關(guān)基因有關(guān)。用無血清培養(yǎng)液處理淋巴管內(nèi)皮細胞后，死亡漂浮細胞增多，細胞形態(tài)皺縮。加入rSulf2后觀察發(fā)現(xiàn)死亡細胞減少，細胞形態(tài)舒展。進一步流式細胞儀檢測證實LECs晚期凋亡的細胞數(shù)量顯著減少，總凋亡率顯著降低，活細胞數(shù)量增多。這些結(jié)果提示，Sulf2可以抑制LECs的凋亡，以抑制晚期凋亡為主。另外，體外成管實驗和裸鼠耳部淋巴管生成模型也進一步顯示，根據(jù)Sulf2 cDNA序列合成的rSulf2能夠增加體外淋巴管數(shù)量及裸鼠耳部的淋巴管數(shù)量，兩者均提示合成的Sulf2對淋巴管生成具有顯著的促進作用。綜上所述，Sulf2對于淋巴管生成起到促進作用，其相關(guān)的作用機制及信號通路研究，將在今后的研究中進行。

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Role of Sulf2 in Promoting Lym phangiogenesis

ZHU Chenfang,NIE Xin,HE Liu,YANG Zhi,GU Yan.Department of

General Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011, China.Corresponding author:GU Yan(E-mail:guyan_8@hotmail.com).

Objective To explore the role of Sulfatase2(Sulf2)in promoting lymphangiogenesis.Methods According to Sulf2 cDNA sequence,pCDH-Flag-Sulf2 eukaryotic expression vector was designed and constructed,then transfected into 293FT cell line to obtain and purify rSulf2.The functions of LECs were examined and compared with control group by flow cytometry,matrigel assay and mice ear lymphangiogenesis model to figure out the effects of rSulf2 on cell cycles,apoptosis, tube formation ability and lymphangiogenesis in LECs.Results The construction of pCDH-Flag-Sulf2 vector was proved correctly by restriction enzyme digestion and sequencing test.Sulf2 expression increased in 293FT cells showed by Western blot.Purified Sulf2 reduced no serum medium induced apoptosis and increased the number of living cells,but it had no effect on cell cycles in LECs.Sulf2 also promoted the tube formation ability in vitro and the number of lymphatic vessels in nude mice ear.Conclusion Sulf2 can inhibit LECs apoptosis and promote lymphangiogenesis.

Heparan sulfate 2;Lymphatic endothelial cells;Lymphangiogenesis

R551.2

A

1673－0364（2015）03－0128－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.003

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科。

顧巖（E-mail：guyan_8@hotmail.com）。