夏 丹，李勇敏，譚小寧，匡 朝，郭建生*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410208；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙410006）

肺癌是發(fā)病率、 死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。 手術(shù)、放療、化療是目前治療肺癌的主要手段，但易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而中醫(yī)藥療法在防治肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 肺復(fù)康為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒的功效，臨床上已取得了較好的療效， 但對(duì)其具體的作用機(jī)制尚無深入研究。 本研究擬建立小鼠Lewis 肺癌移植瘤模型， 探討肺復(fù)康抗肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為其治療肺癌及防治肺癌轉(zhuǎn)移的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與瘤株

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠48 只， 體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。 小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞株，由中南大學(xué)湘雅細(xì)胞中心提供。

1.2 藥物

肺復(fù)康方由白參10 g，黃芪10 g，沙參10 g，麥冬10 g，生地黃10 g，女貞子10 g，靈芝10 g，夏枯草15 g，莪術(shù)9 g，白花蛇舌草20 g，重樓10 g，甘草5 g 組成。生藥煎煮后，濃縮，70%乙醇提純，得干浸膏，備用，1 g 浸膏相當(dāng)于3.58 g 生藥（由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供）。 5-氟尿嘧啶 （5-Fu）， 由上海旭東海普藥業(yè)有限公司提供， 批號(hào)FA120701。

1.3 試劑

RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；Tris（美國(guó)Sigma）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國(guó)Sigma）；Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（Thermo pierce）；兔抗E-cadherin 單克隆抗體（ab133597）、兔抗Vimentin 多克隆抗體（BS1855）、兔抗TGF-β 多克隆抗 體 （Ab66043）、 小 鼠 抗β-actin 單 克 隆 抗 體（60008-1-Ig）、 羊抗兔IgG-HPR、 羊抗小鼠IgGHPR，均由Proteintech 公司提供。

1.4 儀器

DY89-1-電動(dòng)玻璃勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DYY-6C-電泳儀、DYCZ-24EN-電泳槽、DYCZ-40A-轉(zhuǎn)膜儀， 均由北京六一儀器廠提供。

2 方法

2.1 小鼠Lewis 肺癌移植瘤的建立

參照文獻(xiàn)[2-3]方法，將液氮凍存的小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞懸液復(fù)蘇后，搖勻，接種至8 只C57BL/6 小鼠（雌雄各半）右側(cè)腋窩皮下傳代，每只0.2 mL。 3周后，將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，無菌剝離瘤體，取其中生長(zhǎng)良好、無破潰的腫瘤組織，用生理鹽水沖洗后剪碎，勻漿，過200 目篩制成小鼠Lewis 肺癌無菌單細(xì)胞懸液， 用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1.7×107/mL。將上述細(xì)胞懸液迅速接種至30 只小鼠右側(cè)腋窩皮下，0.2 mL/只。

2.2 分組及給藥

小鼠接種后隨機(jī)分為3 組：肺復(fù)康組、5-Fu 組、模型組， 每組10 只， 雌雄各半。 另取同批健康C57BL/6 小鼠10 只（雌雄各半）作為正常組。接種后24 h 開始給藥。 肺復(fù)康組小鼠灌胃17.2 g 生藥/kg，給藥體積為20 mL/(kg·d)，連續(xù)15 d。 5-Fu 組小鼠腹腔注射5-Fu 25 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg，隔天1 次，共給3 次。 模型組及正常組小鼠灌胃與肺復(fù)康組等體積的蒸餾水，連續(xù)15 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 腫瘤體積及抑瘤率測(cè)定 自皮下可觸及腫瘤時(shí)開始， 每3 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑a 及垂直短徑b，按公式V=（1/2）ab2計(jì)算腫瘤體積。末次給藥后24 h 頸椎脫臼處死小鼠，在無菌操作下，完整剝離腫瘤瘤體并立即稱量瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。 抑瘤率=（1-治療組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

稱重后立即取適量腫瘤組織，并取適量癌旁組織，正常組在與其他組小鼠腫瘤生長(zhǎng)部位相應(yīng)部位取一小塊肌肉組織。 將組織分裝后用-70 ℃液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 Western-Blot 檢 測(cè)E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 的蛋白表達(dá) 剪取0.25 g 的腫瘤組織塊，加入RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度， 上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（兔抗Ecadherin 單克隆抗體、兔抗Vimentin 多克隆抗體，稀釋比例1∶500；兔抗TGF-β 多克隆抗體，稀釋比例1∶1 000；小鼠抗β-actin 單克隆抗體，稀釋比例1∶5 000）孵育，TBS-T 緩沖液洗滌15 min×3 次，二抗（羊抗兔IgG-HPR、羊抗小鼠IgG-HPR，稀釋比例1∶3 000） 孵育，TBS-T 緩沖液洗滌15 min×3 次，ECL法顯影，將曝光后的底片掃描。 以β-Actin 為內(nèi)參，測(cè)E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 的蛋白表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為各蛋白與β-Actin 顯影條帶灰度值的比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠死亡情況

肺復(fù)康組于接種后第4 天死亡1 只，解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤向心生長(zhǎng)壓迫胸腔，考慮死亡原因?yàn)樾姆喂δ芩ソ摺?/p>

3.2 各組腫瘤體積、瘤質(zhì)量的比較

隨著時(shí)間的推移， 各組小鼠腫瘤體積越來越大。 5-Fu 組、肺復(fù)康組小鼠腫瘤體積與模型組相比減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見表1。

5-Fu 組、肺復(fù)康組小鼠瘤質(zhì)量與模型組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；5-Fu 組、肺復(fù)康組抑瘤率分別為40%、36%。 見表2。

表1 接種后不同時(shí)間點(diǎn)各組腫瘤體積比較（±s，cm2）

表1 接種后不同時(shí)間點(diǎn)各組腫瘤體積比較（±s，cm2）

注：與模型組比較▲▲P＜0.01。 下表同。

組 別模型組肺復(fù)康組5-Fu 組n 10 9 10第7 天0.59±0.07 0.35±0.05▲▲0.37±0.05▲▲第10 天1.667±0.16 0.975±0.16▲▲0.915±0.15▲▲第13 天2.40±0.31 1.42±0.27▲▲1.44±0.28▲▲第16 天2.87±0.30 2.29±0.30▲▲2.11±0.28▲▲

表2 各組腫瘤質(zhì)量、抑瘤率的比較 （±s）

表2 各組腫瘤質(zhì)量、抑瘤率的比較 （±s）

末次瘤質(zhì)量(g)2.26±0.27 1.45±0.24▲▲1.36±0.23▲▲組 別模型組肺復(fù)康組5-Fu 組n 10 9 10抑瘤率(%)—36 40

3.3 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β表達(dá)的比較

與正常組相比，模型組癌及癌旁組織中E-cadherin 的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Vimentin、TGF-β 的表達(dá)升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），造模成功。 見圖1、表3。 與模型組癌組織相比，5-Fu 組和肺復(fù)康組癌組織中E-cadherin 的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組癌旁組織相比，5-Fu 組和肺復(fù)康組癌旁組織中Ecadherin 的表達(dá)水平升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。 見圖1、表4。

E-cadherin 在模型組癌組織的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（P＜0.05）。 見圖1、表4。

圖1 小鼠癌、癌旁組織中E-cadherin、Vimentin 和TGF-β的蛋白水平電泳圖

表3 模型組與正常組E-cadherin、Vimentin和TGF-β 表達(dá)的比較 （±s，n=4）

表3 模型組與正常組E-cadherin、Vimentin和TGF-β 表達(dá)的比較 （±s，n=4）

注：與正常組比較**P＜0.01。

組 別正常組模型組組織類型—癌組織癌旁組織E-cadherin 0.45±0.02 0.30±0.03**0.33±0.02**Vimentin 0.13±0.02 0.32±0.03**0.31±0.02**TGF-β 0.31±0.02 0.56±0.02**0.56±0.02**

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為肺癌發(fā)病多是在正氣虛損的基礎(chǔ)上，毒、熱外邪侵襲，或痰瘀內(nèi)生而致，因而益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、活血化瘀、化痰軟堅(jiān)合用是中醫(yī)治療肺癌及防治肺癌轉(zhuǎn)移的常用大法。 肺復(fù)康由白參、麥冬、生地黃、夏枯草、莪術(shù)、白花蛇舌草等12 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒之功效，臨床上取得了較好的療效。 由于中藥毒副作用小[4]，適用于癌癥患者的服用， 因此肺復(fù)康的實(shí)驗(yàn)研究具有現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)中，各組接種小鼠均成瘤，表明Lewis 肺癌移植瘤模型建立成功。 通過對(duì)小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量的測(cè)定， 結(jié)果顯示肺復(fù)康可減小腫瘤體積，降低腫瘤質(zhì)量，減慢腫瘤的生長(zhǎng)速度，說明肺復(fù)康對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。

表4 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 表達(dá)的比較 （±s，n=4）

表4 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 表達(dá)的比較 （±s，n=4）

注：與模型組癌組織比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組癌旁組織比較**P＜0.01。

組 別模型組肺復(fù)康組5-Fu 組E-cadherin 0.30±0.03 0.58±0.02▲▲0.60±0.03▲▲Vimentin 0.32±0.03 0.32±0.03 0.32±0.02 TGF-β 0.56±0.02 0.55±0.02 0.55±0.02 E-cadherin 0.33±0.02▲0.59±0.03**0.60±0.02**Vimentin 0.31±0.02 0.31±0.03 0.30±0.02 TGF-β 0.56±0.02 0.57±0.03 0.57±0.03癌組織癌旁組織

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指細(xì)胞從上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，可使腫瘤細(xì)胞表型改變，從而使其獲得較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[5]。 研究表明，上皮標(biāo)志因子E-cadherin 是一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的黏附因子，其表達(dá)的降低導(dǎo)致同源細(xì)胞間粘附力下降，易使腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)，脫離原發(fā)部位向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6-7]。 Vimentin 為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子，其表達(dá)的增高標(biāo)志著EMT 過程的發(fā)生。Zhu 等通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Vimentin 具有維持、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲的作用[8]。在腫瘤發(fā)展的早期，TGFβ 是主要的腫瘤抑制因子； 而在腫瘤發(fā)展的晚期，TGF-β 表達(dá)增強(qiáng)， 高水平的TGF-β 可通過誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移性傳播，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)， 模型組癌及癌旁組織中E-cadherin 的表達(dá)較正常組降低(P＜0.01)；肺復(fù)康組癌、癌旁組織中E-cadherin 的表達(dá)較模型組癌、癌旁組織升高(P＜0.01)，提示肺復(fù)康可能通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)粘附而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。 與正常組相比，模型組癌及癌旁組織中Vimentin、TGF-β 的表達(dá)升高(P＜0.01)；而與模型組癌及癌旁組織相比，Vimentin、TGF-β 的表達(dá)無論是肺復(fù)康，還是5-Fu，都無明顯差異（P＞0.05），表明肺復(fù)康、5-Fu 對(duì)Vimentin、TGF-β 的表達(dá)可能沒有影響。

據(jù)報(bào)道， 肺癌組織中E-cadherin 的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，而Vimentin、TGF-β 的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除Ecadherin 在模型組癌組織的表達(dá)水平低于癌旁組織（P＜0.05）外；各組E-cadherin、Vimentin、TGF-β 的表達(dá)水平，癌組織與癌旁組織相比均無顯著性差異（P＞0.05）。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)取材部位不當(dāng)，距癌組織一定距離處根據(jù)肉眼觀察認(rèn)為該部分組織為良性組織而將其單獨(dú)切取，所取的可能并非癌旁組織。 關(guān)于癌旁組織的取材部位，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道癌旁組織離癌組織的距離各不相同[11，13]，且均為臨床患者肺癌切除標(biāo)本，難以作為小鼠癌旁組織取材的標(biāo)準(zhǔn)。 我們認(rèn)為癌旁組織是與癌變有密切關(guān)系的、伴有良性病變或癌前病變的組織，與癌有組織學(xué)上的過渡，位于癌組織和正常組織之間，沒有具體的范圍，可大可小。 故其取材應(yīng)該是先將癌組織連同可能為“癌旁組織”的組織一起切出，再用切片機(jī)自癌組織一端連續(xù)切片并在光鏡下觀察每張切片的病理形態(tài)學(xué)特征，當(dāng)某張切片的病理形態(tài)明顯不同于前一張時(shí)， 即找到了癌組織與癌旁組織的分界處，此張切片即可作為癌旁組織。

綜上所述， 肺復(fù)康對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞間的黏附能力而抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。 Vimentin、TGF-β 在肺復(fù)康抗肺癌轉(zhuǎn)移中的作用，以及C57BL/6 小鼠癌旁組織的取材部位和方法還有待進(jìn)一步研究。

[1]陳萬青，張思維，曾紅梅，等.中國(guó)2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國(guó)腫瘤，2014，23(1)：1-10.

[2]陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)（第2 版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1018-1019.

[3]梁朝暉，張維彬，潘智然，等.消積飲抑制小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制[J].陜西中醫(yī)，2009，30(4)：497-498.

[4]蔡 美，田 瑩，寧鶴麗，等.中藥益肺飲與化療治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床對(duì)比觀察[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(3)：65-68.

[5]Thiery JP，Acloque H，Huang RYJ，et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease [J]. Cell，2009，139(5)：871-890.

[6]Asnaghi L，Vass WC，Quadri R. et al. E-cadherin negatively regulates neoplastic growth in non-small cell lung cancer：role of Rho GTPases [J]. Oncogene，2010，29(19)：2760-2771.

[7]Schmalhofer O，Brabletz S，Brabletz T. E-cadherin，beta-catenin，and ZEB1 in malignant progression of cancer [J]. Cancer Metastasis Rev，2009，28(1-2)：151-166.

[8]Zhu QS，Rosenblatt K，Huang Kai -lieh. et al. Vimentin is a novel AKT1 target mediating motility and invasion [J]. Oncogene，2011，30(4)：457-470.

[9]Meulmeester E，Ten DP. The dynamic roles of TGF-β in cancer[J]. J Pathology，2011（223）：205-218.

[10]Jeon HS，Jen J. TGF-β Signaling and the Role of Inhibitory Smads in Non-small Cell Lung Cancer [J]. J Thorac Oncol，2010，5(4)：417-419.

[11]陳 鯤，李明珠，李 淼.等.Twist、E-cadherin 和Vimentin 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，38(3)：235-239.

[12]馮保印，劉章鎖，于善法.TGF-β 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J].河南醫(yī)學(xué)研究，2008，17(3)：213-215.

[13]程 波，武 迪，許 琳.等.鈣黏附蛋白和連環(huán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2013，20(11)：685-689.