付小金，劉旺華*，李 花，金朝暉，周小青

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學研究所，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

腦缺血/再灌注損傷是一個快速級聯(lián)反應過程，是由能量代謝障礙、興奮性氨基酸中毒、氧自由基生成增多、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應和細胞凋亡等多種因素參與的病理過程[1]，而影響它的主要病理機制是炎癥反應和細胞凋亡。 核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB） 信號通路可調(diào)控多種炎癥因子及凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥級聯(lián)反應及細胞凋亡等病理過程[2]。 目前，已有大量實驗研究表明，通過抑制NF-κB 信號通路， 下調(diào)相關因子表達，可減輕腦缺血/再灌注損傷。實驗前期研究表明健脾補土方對腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)功能具有保護作用，其機制可能與抑制MMP-2[3]和MMP-9 表達，減少層黏連蛋白降解[4]，抑制無菌性炎癥的產(chǎn)生，從而維護基底膜的完整性保護血腦屏障有關，但其具體機制還不清楚。 本實驗通過研究健脾補土方對大鼠腦缺血后炎癥因子的上游因素NF-κB、NF-κB 抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α，IκBα)表達的影響，探討健脾補土法對腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 動物

健康清潔級SD 雄性大鼠120 只， 體質(zhì)量（240±20）g， 由湖南斯萊克景達實驗動物有限司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2013-0004，動物合格證號：NO43004700006140。

1.2 藥物與試劑

健脾補土方以經(jīng)典四君子湯為基礎配伍，組方：人參15 g，白術12 g，茯苓10 g，黃芪15 g，山藥12 g，薏苡仁12 g，炙甘草6 g。 藥物購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。 藥液制備： 清水浸泡30 min 后，第1 次加6 倍水煎煮40～60 min，第2次加4 倍水煎煮30 min， 將2 次濾藥液混合并水浴濃縮至生藥濃度為1 g/mL，滅菌分裝，4 ℃冷藏備用。依達拉奉注射液（吉林省博大制藥有限公司，規(guī)格：10 mL/15 mg）。 10%水合氯醛、 多聚甲醛系天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品，一抗兔抗大鼠NF-κB/p65（10745-1-AP）、兔抗大鼠IκBα（SC-324882）、兔抗大鼠β-actin （600008-1）系Proteintech 公司產(chǎn)品， 其他試劑由上海國藥生物公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

164-5050 電泳儀（美國Bio-rad 公司），DYCZ-24EN 電泳槽（北京六一廠），DYCZ-40A 轉(zhuǎn)膜儀（北京六一廠），BX51 光學顯微鏡 （日本OLYMPUS 公司），KD-2258 輪轉(zhuǎn)切片機（科迪儀器設備公司）。

1.4 動物分組及給藥

將120 只大鼠隨機分為6 組，每組20 只，分別為假手術組（蒸餾水，灌胃）、模型組（蒸餾水，灌胃）、依達拉奉組(3.2 mg/kg，腹腔注射)、健脾補土方小劑量組(下稱小劑量組，3.69 g/kg，灌胃)、健脾補土方中劑量組(下稱中劑量組，7.38 g/kg，灌胃)、健脾補土方大劑量組(下稱大劑量組，14.76 g/kg，灌胃)，假手術組、模型組給予等體積蒸餾水，劑量根據(jù)人臨床劑量按動物體表面積換算。 模型成功24 h 后開始給藥，每日1 次，每天相同時間連續(xù)給藥7 d。

1.5 動物模型制備及評價

采用改良Longa 等[5]的線栓法建立大腦中動脈閉塞模型，于缺血2 h 后進行再灌注。 假手術組除不插線外，其余步驟同模型組。 參照經(jīng)典的Longa 5級4 分法[4]，于大鼠完全清醒后，采用雙盲法對其神經(jīng)功能缺損評分。 0 分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1 分：不能完全伸展右前肢， 提尾懸吊時右前肢屈曲；2分：爬行時向右轉(zhuǎn)圈，追尾；3 分：爬行時向右傾倒；4分：不能自主行走，意識障礙。 評分為1～3 分者評定為成功模型，可納入研究對象。 不成功者剔除，補充動物，保證每組動物20 只。

1.6 標本采集及處理

灌注后第7 天，每組隨機取大鼠10 只。 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉， 固定后打開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水200 mL，至流出液變清，再緩慢灌注4%多聚甲醛300 mL，灌注固定30 min 至肝臟變硬白后斷頭取腦， 置于4%多聚甲醛固定，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?每組另外10 只大鼠麻醉后迅速斷頭取腦， 在冰上小心剝離軟腦膜，取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)組織， 用冰PBS 洗滌后放入凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 指標檢測

1.7.1 神經(jīng)功能評分 參照Longa 5 級4 分法[4]，各組動物在手術完全清醒后和灌注后第7 天處死前2 h 進行評分。

1.7.2 HE 染色 腦組織置于4%多聚甲醛固定24 h 后，石蠟包埋，行5 μm 厚的連續(xù)冠狀切片，HE染色，高倍光學顯微下觀察神經(jīng)細胞改變。

1.7.3 Western blot RIPA 提取總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。 行10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，蛋白上樣量50～100 μg。 濕式轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉1 h，滴加入相應的NF-κB/p65(1∶500)、IκBα（1∶200）及內(nèi)參β-action（1∶4 000）一抗，4 ℃孵育過夜；滴加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000），室溫孵育45～60 min；ECL 顯色，X 線底片曝光。 Quantity one專業(yè)圖像分析軟件對條帶行灰度掃描分析，以樣品條帶灰度值/相應內(nèi)參灰度值表示目的蛋白的表達。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析， 所有數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。 組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnet，s T3 法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分數(shù)比較

與假手術比較， 模型組神經(jīng)功能缺損評分顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，依達拉奉組、健脾補土方大、中、小劑量組神經(jīng)功能缺損評分均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且依達拉奉組、健脾補土方小、中、大劑量組組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分數(shù)比較 （±s，n=20）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分數(shù)比較 （±s，n=20）

注：與假手術組比較△△P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01。 下表同。

組 別假手術組模型組依達拉奉組小劑量組中劑量組大劑量組劑量（g/kg）— —0.0032 3.69 7.38 14.76神經(jīng)缺損分數(shù)（分）0.000±0.000 2.330±0.580△△1.510±0.330#1.690±0.700#1.530±0.330##1.500±0.700##

2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)細胞的形態(tài)學觀察

假手術組：細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常，胞核清晰，核仁大圓而完整，胞質(zhì)色淡且均勻，胞漿豐富，血管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤（見封三彩圖圖1-A）。模型組：呈明顯的缺血性損害改變，正常組織結(jié)構(gòu)消失，大量細胞壞死，多數(shù)細胞體積縮小，胞核固縮深染，排列紊亂，胞質(zhì)明顯減少，炎性細胞浸潤，并可見呈空泡性壞死灶（見封三彩圖圖1-B）。 小劑量組： 缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細胞損傷較模型組有所減輕，正常的神經(jīng)元細胞增多，炎癥細胞浸潤減少，少量的空泡性壞死（見封三彩圖圖1-D）。 中、大劑量組與依達拉奉組：缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細胞損傷較模型組明顯減輕，正常的神經(jīng)元細胞明顯增多，少量炎癥細胞浸潤，未見明顯空泡性壞死（見封三彩圖圖1-C、E、F）。

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)NF-κB/p65 和IκBα 蛋白相對表達量的比較

與假手術組比較，模型組胞核內(nèi)NF-κB/p65 蛋白顯著增多（P＜0.01）， 胞漿內(nèi)IκBα 蛋白顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，依達拉奉組和健脾補土方大、中、小劑量組胞核內(nèi)NF-κB/p65 表達減少（P＜0.05 或P＜0.01）， 胞漿內(nèi)IκBα 蛋白表達增多 （P＜0.05 或P＜0.01），依達拉奉組、健脾補土方小、中、大劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2，圖2。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)NF-κB/p65、IκBα 蛋白相對表達量的比較 （±s，n=10）

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)NF-κB/p65、IκBα 蛋白相對表達量的比較 （±s，n=10）

組 別假手術組模型組依達拉奉組小劑量組中劑量組大劑量組NF-κB/p65/β-actin 0.297±0.045 0.428±0.055△△0.365±0.032#0.371±0.017#0.365±0.003##0.365±0.002##IκBα/β-actin 0.450±0.060 0.230±0.030△△0.360±0.050#0.350±0.050#0.370±0.040##0.300±0.007##

圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)NF-κB/p65、IκBα 蛋白表達電泳圖

3 討論

缺血性腦卒中是指各種原因?qū)е碌哪X部血流供應障礙，腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應神經(jīng)功能缺損的疾病，是腦血管疾病（CVD）最常見的類型，嚴重影響人類生存質(zhì)量，是威脅人類健康最嚴重的疾病之一。

有研究表明，NF-κB 是應激與炎性反應的中樞調(diào)節(jié)物[6]，被認為是腦缺血后炎癥級聯(lián)反應中最重要的調(diào)控因子之一。當細胞處于靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制性蛋白IκB 結(jié)合，以無活性的二聚體滯留于細胞內(nèi)。腦缺血/再灌注后，釋放大量活性氧、氧自由基、興奮性氨基酸及內(nèi)毒素，細胞受到這些信號刺激后，IκB 激酶IKKs 磷酸化， 導致IκB 泛素化及降解，NF-κB 與IκB 解離、暴露出Rel 蛋白上的結(jié)合位點，NF-κB 被激活，與DNA 特定序列結(jié)合，誘導相關基因轉(zhuǎn)錄和表達，從而激活炎癥因子及細胞因子，導致缺血后炎癥反應的發(fā)生[7]。 目前，已有大量實驗研究表明[8-9]，通過提高IκBα 的表達，抑制NF-κB 的表達，從而發(fā)揮保護大腦神經(jīng)元，改善缺血/再灌腦組織損傷的作用。

健脾補土方以人參為君，以白術、茯苓、黃芪為臣，佐以山藥、薏苡仁，使以炙甘草，全方具有健脾益氣的功效。 實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷、 人參皂苷Rg1、Rb1 能抗小鼠腦缺血再灌注后氧化應激損傷和改善能量代謝[10]，這些可能是健脾補土方抗腦缺血/再灌注損傷作用的基礎之一。

Wester blot 結(jié)果顯示， 健脾補土方促進腦缺血/再灌注損傷后胞漿內(nèi)IκBα 蛋白表達，而抑制胞核內(nèi)NF-κB/p65 的表達， 提示健脾補土方可抑制腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)胞核NF-κB/p65 蛋白的核轉(zhuǎn)位和胞漿IκBα 蛋白的降解， 導致NF-κB 信號通路的激活被抑制， 進而抑制各種炎性細胞因子的表達而產(chǎn)生抗炎作用。

以上實驗結(jié)果綜合表明健脾補土方對腦缺血再灌注損傷有保護作用，其具體機制可能是通過抑制NF-κB/p65 蛋白的核轉(zhuǎn)位和胞漿IκBα 蛋白的降解，從而抑制NF-κB 炎性信號通路的激活而抗腦缺血/再灌注損傷。 此外，有實驗研究表明NF-κB 信號通路還直接參與促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6），炎癥介質(zhì)如P 選擇素等黏附分子表達與調(diào)控。 如α-硫辛酸能夠降低TNF-α 的表達來抑制NF-κB 的活性，達到保護局灶性腦缺血再灌注后的炎性反應損傷[11]。 滇橄欖提取物可降低IL-1β、IL-6和NF-κB 的表達來抗氧化和抑制炎癥反應，保護大鼠腦缺血再灌注損傷[12]，也驗證了本實驗的結(jié)論。

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