王 康,李 韻,肖少紅

湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站,武漢市硚口區(qū)寶豐路6號 430030

HPLC-FLD柱前衍生法同時測定煙草中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2

王 康,李 韻,肖少紅

湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站,武漢市硚口區(qū)寶豐路6號 430030

通過溶劑萃取、免疫親和柱純化富集、三氟乙酸柱前衍生、高效液相色譜(HPLC)法分離及熒光檢測器檢測,建立了同時測定煙草及煙草制品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的免疫親和檢測方法.結(jié)果表明:①該方法可在20 min內(nèi)完成測定,4種目標物能夠得到很好的分離,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r值均大于0.99.②方法的回收率為85%～117%,相對標準偏差為0.2%～9.4%(n=6),其中B1的檢出限和定量限分別為0.10和0.34 μg/kg.

煙草;黃曲酶毒素;柱前衍生;高效液相色譜法(HPLC)

黃曲霉毒素(Aflatoxin,簡稱AFT)是20世紀60年代初發(fā)現(xiàn)的一類劇毒的真菌代謝產(chǎn)物,主要由黃曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)等侵染農(nóng)產(chǎn)品后產(chǎn)生[1],是目前已知最強的致癌物之一.1993年,AFT被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)劃定為一級致癌物[2].目前發(fā)現(xiàn)的 AFT 有十幾種,其中B1、B2、G1和G2較為常見,黃曲霉毒素B1(簡稱AFB1,其余類推)的毒性最強.黃曲霉毒素廣泛地存在于霉變的大米、花生、玉米、棉籽等農(nóng)產(chǎn)品中,是食品安全和食品國際貿(mào)易的巨大威脅[3-4].煙葉在貯藏過程中,也面臨著霉變的威脅.

AFT的檢測方法主要有薄層層析法[5]、高效液相色譜-熒光檢測法(High performance liquid chromatography-fluorescencedetection,HPLC-FLD)[6-7]和酶聯(lián)免疫法[8]等.薄層層析法過程復(fù)雜且靈敏度差,酶聯(lián)免疫法存在假陽性和培育合適的抗原抗體困難的問題.HPLC-FLD法測定準確、分辨率高,可同時定性、定量測定多種AFT成分[9-10],此方法一般要經(jīng)過樣品的凈化和衍生化.目前主要使用免疫吸附柱來純化萃取液并富集AFT[11-13].免疫吸附柱是通過偶聯(lián)的抗體對AFT進行特異性吸附而達到富集的效果,其富集效率高,選擇性強,是目前AFT最為有效的固相萃取柱.衍生化方法可分為柱前衍生和柱后衍生,柱后衍生對于設(shè)備有較高要求,使用不便,不宜普及.目前,有關(guān)糧油中AFT的檢測研究報道很多[14-15],而煙草中AFT檢測方面的相關(guān)研究很少[16].因此,采用免疫親和柱純化富集、HPLC-FLD柱前衍生法,對衍生化時間、色譜條件等進行了優(yōu)化,建立了一種簡單快速、適用于檢測煙草中AFT的方法,旨在為應(yīng)對未來更為嚴格的煙草質(zhì)量安全要求提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草樣品共16個(其中2012年和2013年湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站接受的監(jiān)督檢測樣品留樣各8個).

AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的標準樣品(3 mg/L苯溶液,上海安譜科學儀器有限公司);甲醇、乙腈、正己烷(色譜純,德國CNW公司);三氟乙酸(AR,北京百靈威科技有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司).

Summit P680A高效液相色譜儀(配有RF2000熒光檢測器,美國Dionex公司);AL204電子天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);57044型手動固相萃取儀(美國Supelco公司);KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);黃曲霉毒素免疫親和柱(1 mL,美國Beacon公司).

1.2 方法

稱取2.00 g煙末樣品,置于30 mL帶蓋塑料瓶中,加入20 mL體積分數(shù)為80%的甲醇溶液,常溫超聲提取10 min,每隔2 min振蕩1次;提取結(jié)束后,過濾,取5 mL濾液,加入20 mL純水稀釋,以1 mL/min的流速通過免疫親和柱;然后以20 mL純水分兩次淋洗親和柱;最后用1 mL甲醇洗脫免疫親和柱上富集的AFT.將甲醇洗脫液用氮氣小心吹干,然后加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷,渦旋振蕩后在40℃恒溫箱內(nèi)衍生1 h,加入0.9 mL體積分數(shù)為50%的甲醇溶液,取下層溶液進行HPLC分析.分析條件為:

色譜柱:Agilent ZORBAX Bonus-RP C18柱(4.6 mmX250 mm,5 μm);柱溫:30℃;流動相及洗脫方式:乙腈-水(25∶75,體積比)二元流動相等度洗脫分離;流動相流速:1.0 mL/min;檢測方式:熒光檢測器(Ex 360 nm,Em 440 nm);進樣量:100μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生化條件

分子發(fā)射的熒光與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[17].黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、B2a和 G2a的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示.AFB1和AFG1的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)上具有獨立的不飽和雙鍵,二者在紫外光照射下發(fā)射的熒光較弱[18].在三氟乙酸的作用下,AFB1和AFG1分子可轉(zhuǎn)化為具有強熒光的AFB2a和AFG2a分子[19-20](圖1).AFB2a和AFG2a為AFB1、AFG1與酸反應(yīng)生成的半縮醛結(jié)構(gòu).為提高AFB1、AFG1分子檢測的靈敏度,可通過衍生化將其轉(zhuǎn)化為AFB2a和AFG2a分子.根據(jù)文獻[21-22]報道的實驗過程,AFT經(jīng)從免疫親和柱上洗脫后,所得到的甲醇溶液需先用氮氣吹干,加入三氟乙酸衍生化后再經(jīng)氮氣吹干,然后定容、上樣分析.但本研究中發(fā)現(xiàn),衍生化后再經(jīng)氮氣吹干,衍生化的效果較差.這可能與AFB2a和AFG2a分子的穩(wěn)定性低有關(guān),在氮氣吹干的過程中,衍生化反應(yīng)后得到的半縮醛可再次分解,使衍生化效果減弱[23].為了提高衍生化效果,在本研究中,衍生化后未采用氮氣吹干.

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、B2a和G2a的結(jié)構(gòu)

隨著衍生化過程的推進,AFB1逐漸轉(zhuǎn)化為AFB2a分子,因此通過監(jiān)測AFB2a的熒光強度變化可以監(jiān)測衍生化的反應(yīng)進程.圖2是常溫下AFB1衍生過程的熒光監(jiān)控結(jié)果.如圖2所示,隨著反應(yīng)的進行,AFB2a分子的生成量逐漸增大,熒光強度也隨之增強,最終達到平衡狀態(tài).如果將平衡狀態(tài)下的AFB1的轉(zhuǎn)化率設(shè)為100%,根據(jù)熒光強度的比值即可計算出不同時間AFB1的轉(zhuǎn)化率.根據(jù)文獻[24-25]報道,加入三氟乙酸后衍生化所需的時間在15～20 min之間.AFB1在不同衍生化溫度條件下轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時間的關(guān)系見圖3.可知,在常溫下,衍生化完全需要3 h以上;在45℃條件下,經(jīng)過1 h,即可以衍生化完全.

圖2 25℃時AFB1衍生化過程中熒光強度隨時間的變化

圖3 不同溫度下衍生化過程中AFB1轉(zhuǎn)化率隨時間的變化

2.1.2 色譜條件

流動相的組成會影響分離度和目標物保留時間.考察了流動相組成的影響,通過研究甲醇-水、乙腈-水體系發(fā)現(xiàn)AFB2與AFB2a、AFG2與 AFG2a在甲醇-水體系內(nèi)基線無法分離,而在乙腈-水體系內(nèi)分離度較好.通過實驗優(yōu)化得到乙腈-水的最佳比例為25∶75(體積比),在20 min內(nèi)可以得到滿意的分離效果.4種黃曲霉毒素的出峰先后順序為AFG2、AFG1、AFB2、AFB1(圖4).

圖4 經(jīng)HPLC分離的4種黃曲霉毒素

2.2 方法的驗證

2.2.1 工作曲線、檢出限及定量限

配制 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2的標準混合溶液.分別取一定體積的標準混合儲備液,經(jīng)氮氣吹干,三氟乙酸衍生化后定容,得到AFT的系列標準混合溶液(AFB1和AFG1轉(zhuǎn)化為 AFB2a和AFG2a的形式存在,為方便計算,后文中仍然以AFB1和AFG1表示),其中 AFB2的濃度為 0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 和 2.500 ng/mL,AFG2、AFG1、AFB1的濃度均為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50和5.00 ng/mL.將所得標準混合溶液進行HPLC-FLD分析,采用外標法定量,以目標物的峰面積Y對其濃度X進行回歸分析,并按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比來確定各分析物的檢出限和定量限,得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限如表 1 所示.在 0.1～10.0 μg/kg 范圍內(nèi),AFG2、AFG1、AFB1呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系;在0.05～5.00 μg/kg范圍內(nèi),AFB2呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系.其中AFB1的檢出限和定量限分別為0.10和0.34 μg/kg,完全可以滿足歐盟針對直接食用食物中AFT總量和AFB1分量設(shè)定的限量(最大殘留限量:AFT總量≤4 μg/kg,AFB1≤2 μg/kg)的檢測要求.考慮到煙草的吸食特性,由卷煙煙氣攝入人體的量比直接食用少得多.

2.2.2 回收率和重復(fù)性

在煙葉樣品中分別添加0.2、1.0和5.0 μg/kg水平的 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2標準品,測定該 4種AFT的回收率,每種濃度添加進行6次平行實驗,根據(jù)結(jié)果計算方法的加標回收率及加標后測定值的相對標準偏差(RSD).結(jié)果(表2)表明,方法的回收率高、重復(fù)性好.

表1 4種黃曲霉毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖5為添加5.0 μg/kg水平AFT標準品的煙葉樣品的色譜圖.可以看出,經(jīng)免疫親和柱富集和凈化,煙葉萃取液中的大部分雜質(zhì)均能被有效除去,殘留的雜質(zhì)能與目標物有效分離,對目標物無干擾.

表2 方法的加標回收率及重復(fù)性(n=6)

圖5 添加5 μg/kg水平黃曲霉毒素標準品的煙葉樣品的HPLC圖

2.3 實際樣品的測定結(jié)果

實際樣品為2012年和2013年的16個煙草監(jiān)督檢測樣品的留樣,其中2012年的8個樣品保存狀態(tài)較差,目測已有一定程度的霉變.按照1.2節(jié)的步驟處理煙草樣品,經(jīng)HPLC-FLD分析,結(jié)果表明:2013 年的 8 個樣品中,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均未檢出;2012年的8個樣品中僅一個樣品中檢出AFB1,質(zhì)量分數(shù)為0.44 μg/kg,低于歐盟針對直接食用食物的限量要求;其他樣品均未檢出該4種AFT.

3 結(jié)論

建立的檢測黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2的HPLC-FLD柱前衍生法的檢出限低,回收率(85.4%～117.8%)和重復(fù)性好,相對標準偏差為0.2%～9.4%(n=6),適用于煙草及煙草制品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2的檢測.

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責任編輯 茹呈杰

Simultaneous Determination of Aflatoxins B1,B2,G1and G2in Tobacco by HPLC-FLD Pre-column Derivatization Method

WANG Kang,LI Yun,and XIAO Shaohong
Hubei Province Tobacco Quality Supervisionamp;Test Station,Wuhan 430030,China

An immunoaffinity detection method for simultaneously determining the aflatoxins B1,B2,G1and G2in tobacco and tobacco products was developed via solvent extraction of sample,purifying and concentrating on immunoaffinity column,pre-column derivatization by trifluoroacetic acid,separation by HPLC,and detection by fluorescence detector.The results showed that:1)The determination could be completed within 20 minutes,the four target aflatoxins were well separated and exhibited good linear relations with correlation coefficients rgt;0.99.2)The recoveries of the method ranged from 85%to 117%with the relative standard deviation (RSD)of 0.2%-9.4% (n=6),and the limits of detection and quantification of aflatoxin B1were 0.10 and 0.34 μg/kg,respectively.

Tobacco;Aflatoxin;Pre-column derivatization;HPLC

TS411.1

A

1002-0861(2015)10-0057-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151010

2015-02-09

2015-07-09

王康(1986-),博士,工程師,主要從事煙草化學研究.E-mail:wangkang4907@163.com

王康,李韻,肖少紅.HPLC-FLD柱前衍生法同時測定煙草中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2[J].煙草科技,2015,48(10):57-61.

WANG Kang,LI Yun,XIAO Shaohong.Simultaneous determination of aflatoxins B1,B2,G1and G2in tobacco by HPLC-FLD pre-column derivatization method[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):57-61.