李橫江 黃慧艷 張小菊

摘要：根據(jù)MaizeDGB數(shù)據(jù)庫中ZmCIPK6基因序列設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)從玉米中克隆了1個ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因cDNA全長1 739 bp，5′-非編碼區(qū)長281 bp， 3′-非編碼區(qū)長111 bp， 編碼區(qū)長1 347 bp，編碼448個氨基酸，預測分子量為48.8 KDa，等電點為9.14。氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，ZmCIPK6與高粱SbCIPK6同源性較高。根據(jù)ZmCIPK6的基因序列和植物表達載體pCAMBIA3301的多克隆位點設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶位點的特異性引物，以質(zhì)粒pMD18-T-ZmCIPK6為模板，PCR擴增ZmCIPK6基因片段，雙酶切目的片段及載體，回收后連接，構(gòu)建成該基因的植物表達載體。經(jīng)PCR檢測及測序鑒定，表明成功構(gòu)建了ZmCIPK6基因的植物表達載體，為進一步遺傳轉(zhuǎn)化研究基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米；ZmCIPK6基因；植物表達載體

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5432-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.059

Cloning of ZmCIPK6 Gene and Construction of Its Plant Expression Vector

LI Heng-jiang， HUANG Hui-yan， ZHANG Xiao-ju

（Urban Construction School， Huazhong University of Science and Technology Wuchang Branch， Wuhan 430067， China）

Abstract：According to the sequence of ZmCIPK6 in MaizeDGB database，primers were designed. RT-PCR method was used to clone ZmCIPK6 gene. A gene coding for ZmCIPK6 was isolated from maize （Zea mays）.The full length ZmCIPK6 cDNA was 1 739 bp，including a 281 bp 5′-UTR，an ORF of 1 347 bp，and a 111 bp 3′-UTR.This cDNA sequence encoded a polypepide of 448 amino acid residues with a predicted molecular mass of 48.8 kDa and a basic isoelectric point of 9.14. The deduced amino acid sequence had a high homology with SbCIPK6 from Sorghum bicolor.According to the restriction enzyme sites of expression vector pCAMBIA3301 and sequence of ZmCIPK6 gene，one pair of primers containing restriction enzyme sites were designed. The ZmCIPK6 gene was obtained from pMD18-T-ZmCIPK6 by PCR. PCR product and the plasmid pCAMBIA3301 were digested by the corresponding restricted enzymes respectively，and then the ZmCIPK6 gene was cloned into pCAMBIA3301 vector.PCR and sequencing results suggest that plant expression vector of ZmCIPK6 gene was constructed successfully.

Key words： maize；ZmCIPK6 gene； plant expression vector

玉米是重要的飼料作物，又是食品、化工、燃料、醫(yī)藥等行業(yè)的重要原料。中國是僅次于美國的第二大玉米產(chǎn)銷國，玉米在中國糧食安全中起著極其重要的作用。干旱、鹽堿和極端的溫度等外界非生物脅迫對玉米的生長和發(fā)育產(chǎn)生負面影響，嚴重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。許多轉(zhuǎn)錄因子、功能基因和蛋白激酶能夠?qū)ν饨绲姆巧锩{迫產(chǎn)生應答，使植物產(chǎn)生對外界脅迫的抵抗能力[1，2]。在玉米抗逆脅迫中蛋白激酶CIPK具有重要的作用，逆境脅迫誘導CIPKs基因的表達，例如，在擬南芥中異位表達ZmCIPK16增強轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力[3]。ZmCIPK21受干旱、高鹽、高溫和ABA脅迫誘導表達[4]。ZmCIPK10基因受非生物脅迫誘導表達[5]。ZmCIPK1、ZmCIPK17和ZmCIPK18受干旱和低溫脅迫誘導表達[6]。在玉米幼苗葉片中，ZmCIPK1受甘露醇、氯化鈉、ABA和低溫誘導表達量明顯上調(diào)，在24 h內(nèi)保持較高的轉(zhuǎn)錄水平[7]。ZmCIPK3受NaCl、ABA、甘露醇和低溫的誘導，轉(zhuǎn)錄水平在12 h內(nèi)呈上升趨勢[8]。ZmCIPK42基因主要受高鹽和高熱脅迫誘導表達，中等程度受干旱脅迫誘導表達，不受ABA和低溫脅迫誘導[9]。NaCl和ABA誘導3個玉米CIPK基因AY104819，EU974290和EU968441的表達[10]。以上研究表明，這些玉米CIPK基因在植物應答逆境脅迫的信號傳導過程中具有重要的作用。本研究利用RT-PCR方法從玉米中克隆了1個ZmCIPK6基因的cDNA并構(gòu)建了該基因的植物表達載體，為ZmCIPK6基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為玉米自交系B73。

1.2 方法

1.2.1 玉米材料處理 種子經(jīng)0.1% HgCl2消毒，播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，在光照培養(yǎng)箱中以28 ℃12 h 光照，22 ℃12 h黑暗條件下培養(yǎng)至三葉期，取玉米葉片，立即經(jīng)液氮冷凍，-80 ℃保存，供提取總RNA。

1.2.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成 按照植物RNA提取試劑TRIzol[天根生化科技（北京）有限公司]的操作說明書提取玉米葉片總RNA，總RNA用DNase I （北京全式金生物技術(shù)有限公司）處理，去除基因組DNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]的操作步驟合成cDNA第一鏈，產(chǎn)物作為基因克隆的模板。

1.2.3 克隆ZmCIPK6全長cDNA及序列分析 根據(jù)ZmCIPK6序列設(shè)計引物， CIPK6-F（5′-CCGCGATCCCGTGCTTCCTTCTCGCA-3′）和CIPK6-R（5′-TATCGAATCGAGAACAGTGACGCAATCA-3′），以玉米自交系B73葉片cDNA第一鏈為模板，使用LA-Taq[寶生物工程（大連）有限公司]擴增基因全長cDNA，按說明書的體系和PCR程序進行擴增。PCR產(chǎn)物亞克隆至pMD18-T[寶生物工程（大連）有限公司]載體，經(jīng)菌液PCR檢測后，陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。利用DNAMAN軟件進行多重序列比較和進化樹分析。

1.2.4 構(gòu)建ZmCIPK6的植物表達載體 根據(jù)ZmCIPK6基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位點設(shè)計1對引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位點，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位點，引物為CIPK6p-F（5′-GCGCCATGGCCGCGATCCCGTGCTTCCTTCTC-3′）、CIPK6p-R（5′-GGCAGATCTTATCGAATCGAGAACAGTGACGCAA-3′）。獲得帶有酶切位點的PCR產(chǎn)物，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切后亞克隆至植物表達載體pCAMBIA3301，菌液PCR檢測是否有片段插入，陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCIPK6基因的克隆及分析

根據(jù)MaizeDGB數(shù)據(jù)庫中的ZmCIPK6序列，從玉米葉片中克隆了1個ZmCIPK6基因。ZmCIPK6全長cDNA長1 739 bp，編碼區(qū)長1 347 bp，5-非編碼（UTR）區(qū)長281 bp， 3-UTR長111 bp，編碼448個氨基酸（圖1）。ZmCIPK6氨基酸序列預測分子量為48.8 KDa，等電點為9.14。1個激酶結(jié)構(gòu)域和1個CIPK家族中保守的NAF調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域分別位于ZmCIPK6蛋白的N端區(qū)和C端（圖2）。

進化樹分析發(fā)現(xiàn)，ZmCIPK6蛋白質(zhì)與高粱、谷子、大麥、烏拉圖小麥、水稻和二穗短柄草中的CIPK6蛋白質(zhì)高度同源，一致性達81.4%～93.5%，其中與高粱CIPK6蛋白質(zhì)的進化關(guān)系最近，共同分在一個進化分支（圖3）。

2.2 ZmCIPK6基因植物表達載體的構(gòu)建及鑒定

采用PCR方法獲得了帶有NcoⅠ和Bgl Ⅱ酶切位點的擴增產(chǎn)物，大小為1 757 bp（圖4）。將該產(chǎn)物亞克隆至植物表達載體pCAMBIA3301中，采用菌液PCR的方法對重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmCIPK6進行鑒定，結(jié)果表明，能夠從轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-ZmCIPK6的大腸桿菌菌液中擴增出大小為1 757 bp的目的片段。測序結(jié)果表明，插入的序列與ZmCIPK6序列完全一致，表明成功構(gòu)建了pCAMBIA3301-ZmCIPK6（圖5）。

3 小結(jié)

本研究克隆了1個玉米ZmCIPK6基因，通過生物信息學方法預測ZmCIPK6中含有CIPK家族保守的功能域，而且通過同源性和進化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因與其他植物中的CIPK6蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有高度的同源性，說明本研究克隆的ZmCIPK6基因是玉米CIPK家族的1個成員。本研究構(gòu)建的ZmCIPK6基因植物表達載體，為下一步轉(zhuǎn)化玉米對該基因在逆境脅迫中的功能分析奠定基礎(chǔ)。

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