朱作華 蔡霞 嚴(yán)理 李智敏 謝純良 胡鎮(zhèn)修 彭源德

摘要：蘆葦（Phragmites australis）是一種有潛力的能源作物，為優(yōu)化蘆葦酶解糖化工藝，應(yīng)用Plackett- Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響蘆葦酶糖化的重要參數(shù)，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)確定重要參數(shù)的最佳水平，應(yīng)用高效液相色譜儀（HPLC）對(duì)糖化過(guò)程中的單糖種類(lèi)及含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，影響蘆葦酶糖化的重要參數(shù)是H2SO4濃度、Tween-80和MnSO4濃度，最佳工藝參數(shù)為H2SO4濃度0.88%、表面活性劑Tween-80添加量0.61%、MnSO4添加量0.26%，在此條件下，8～10 h可以完成糖化，總還原糖濃度達(dá)到45.68 mg/mL，同時(shí)驗(yàn)證了數(shù)學(xué)模型的有效性，液相分析表明糖化液中主要的糖種類(lèi)為葡萄糖和木糖，其含量分別為21.36、16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖含量較少。

關(guān)鍵詞：蘆葦（Phragmites australis）；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；酶解；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：S216.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5387-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.047

Hydrolysate Alalyze and Enzymatic Saccharification Conditions Optimization of Reed by Steam Explosion Pretreatment

ZHU Zuo-hua， CAI Xia， YAN Li， LI Zhi-min， XIE Chun-liang， HU Zhen-xiu， PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， Hunan， China）

Abstract：Reed （Phragmites australis）was a kind of alternative raw material for bio-ethanol production. The important parameters of influencing enzymatic sacharification for reed were screened by Plackett-Burman design. Furthermore， based on Box-Behnken design， the enzymatic saccharification conditions of reed by steam explosion pretreatment were optimized by response surface methodology， and a mathematial model of a second order quadratic equation was developed for reducing sugar conentration. The hydrolysate was alalysed by HPLC. The resutlts suggested that the three important parameters included dilute sulphuric acid， Tween-80 and manganese sulfate concentration. The optimized technologial parameters were as follows： dilute sulphuric acid concentration 0.88%，、Tween-80 concentration 0.61%， manganese sulfate contration 0.26%. The reducing sugar concentration was up to 45.68 mg/mL. The results verified the validity of the mathematical model. The concentrations of glucose and xylose were 21.36 mg/mL and 16.62 mg/mL， respectly. Contents of arabinose， cellobiose and galactose were very low.

Key words：reed（Phragmites australis）； Plackett-Burman design； Box-Behnken design； enzymatic saccharification； response surface methodology

蘆葦（Phragmites australis）是多年生草本植物，分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高，不需要施肥，全世界約有1 000萬(wàn)hm2，而我國(guó)現(xiàn)有14個(gè)蘆葦主產(chǎn)區(qū)，面積達(dá)130萬(wàn)hm2以上[1，2]。目前，蘆葦在農(nóng)村主要用于牲畜的草料和草墊等，工業(yè)上主要用作造紙?jiān)蟍3，4]。蘆葦?shù)漠a(chǎn)量和質(zhì)量主要取決于當(dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)條件，每公頃產(chǎn)量15～35 t干基，莖桿纖維素含量40%以上，半纖維素含量30%左右，可用于燃料乙醇的生產(chǎn)，是一種很有潛力的可再生能源作物[5-7]。

由于木質(zhì)纖維素原料本身的理化特性及結(jié)構(gòu)組成的復(fù)雜性，酶有效降解纖維素前必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)程[8，9]。目前，比較有效的預(yù)處理方法包括利用酸、堿等化學(xué)預(yù)處理和蒸氣爆破預(yù)處理。酸預(yù)處理能夠溶解掉半纖維素，但易產(chǎn)生副產(chǎn)物；堿預(yù)處理可以更有效地去除木質(zhì)素，但半纖維素可能變?yōu)殡y溶的聚合物；生物法也可以取得良好的預(yù)處理效果，但處理時(shí)間較長(zhǎng)[10-12]。蒸氣爆破法由于具有處理時(shí)間短、化學(xué)試劑用量少、污染小、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是木質(zhì)纖維素原料有效的預(yù)處理方法之一。

影響纖維質(zhì)原料酶糖化的因素很多，且各因素間可能存在交互作用，單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到的結(jié)果不夠嚴(yán)密。響應(yīng)面分析法可以設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與參數(shù)變量間的關(guān)系，分析一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和2個(gè)因子間的一級(jí)交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，近年來(lái)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到工藝條件的確定[13-15]。本研究在前期化學(xué)預(yù)處理、蒸氣爆破預(yù)處理研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響蒸氣爆破蘆葦糖化的重要參數(shù)，然后通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析確定蘆葦糖化重要參數(shù)的最佳水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆葦取自益陽(yáng)市沅江洞庭湖區(qū)，經(jīng)自然風(fēng)干后剪碎。纖維素酶由高寶公司和湖南尤特爾公司提供，酶活力分別為2 587 U/mL和3 734.64 U/mL，木聚糖酶由廣東華芬酶有限公司和湖南尤特爾公司提供，酶活力分別為1 9425 U/mL和9 644 U/mL。硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、PMP等試劑均為分析純，3，5-二硝基水楊酸為生化純，甲醇、乙腈為色譜級(jí)，甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖為SIGMA-ALDRICH公司試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UX6200H型電子天平（日本島津公司）；Mettler Toledo Delta 320型精密pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；756型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；RH-Q型恒溫?fù)u床（金壇榮華儀器制造有限公司）；移液器（德國(guó)EPPENDORF公司）；YXQ-LS-50SⅡ型高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國(guó)熱電公司）；QB-200型蒸氣爆破機(jī)（鶴壁市正道重機(jī)廠(chǎng)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆葦酶解 稱(chēng)取100 g蘆葦樣品，加入500 mL稀硫酸溶液浸泡10 h左右，使蘆葦樣品充分浸濕，濾去濾液，濾渣進(jìn)行汽爆處理，氣爆壓力2.0 MPa，維壓時(shí)間120 s，氣爆后原料按一定比例加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為5.5，加入適量木聚糖酶和纖維素酶進(jìn)行酶解，酶解條件為48 ℃、150 r/min，48 h后分別測(cè)定總還原糖，取平均值。

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn) Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種有效的兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的因素。纖維素預(yù)處理酶水解工藝中涉及的參數(shù)較多，Plackett-Burman適合于本試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5，6，16]，本試驗(yàn)選取7個(gè)影響因子作為獨(dú)立考察的因素，見(jiàn)表1。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)篩選的3個(gè)最重要影響因素（H2SO4濃度、Tween-80和MnSO4） 進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化研究，以酶解液中的總糖濃度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，通過(guò)軟件計(jì)算分析確定重要試驗(yàn)因子的水平，從而獲得最佳的蘆葦預(yù)處理酶水解工藝參數(shù)，其他參數(shù)為浴比1∶2，酶配比為10%高寶纖維素酶+5%華芬木聚糖酶，0.1%CoCl2，不添加Tween-20。

1.3.4 分析方法 酶解液中還原糖濃度采用DNS法測(cè)定[17]；葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖濃度的測(cè)定采用高效液相色譜法，使用高效液相色譜儀，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，色譜柱為C18；流動(dòng)相為0.1 mol/L硫酸銨和乙腈，體積比為81∶19，流速為1.2 mL/min，柱溫為30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表4?！癙rob>F”小于0.05時(shí)，表明該因素是重要的?！癕odel Prob>F”為0.032 5時(shí)，表明該模型是重要的。7個(gè)因素的重要性順序依次為H2SO4濃度、MnSO4、Tween-80、浴比、CoCl2、酶配比、Tween-20。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，其中中心值重復(fù)3組試驗(yàn)，利用Design Expert軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值總還原糖濃度（Y）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：Y=44.25-4.76×A-0.15×B+1.96×C+0.6×A×B+0.18×A×C-0.44×B×C-7.5×A2-0.62×B2-0.85×C2，進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表6。回歸模型方程的回歸系數(shù)為R2=0.98，方差分析顯示“Model Prob>F”為0.000 3，說(shuō)明該模型是重要的，表明試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)據(jù)的擬合方法是合理的，該模型可用于預(yù)測(cè)蘆葦原料預(yù)處理后酶解糖化過(guò)程中總還原糖濃度的變化。顯著性水平（P<0.05）條件下，因素A和C對(duì)總還原糖糖濃度的線(xiàn)性效應(yīng)顯著，因素B不顯著；因素A2對(duì)總還原糖濃度的曲面效應(yīng)顯著，B2和C2不顯著；AB、AC、BC的交互作用不顯著。

通過(guò)上面多元回歸方程作響應(yīng)曲面及其等高線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 最佳工藝條件確定與驗(yàn)證

在前面響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)軟件模擬，當(dāng)H2SO4濃度為0.88%，Tween-80添加量為0.61%，MnSO4添加量為0.26%時(shí)，總還原糖濃度達(dá)到最大值46.40 mg/mL。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，依據(jù)該參數(shù)處理蘆葦桿，其他參數(shù)不變，3次重復(fù)，總還原糖濃度分別達(dá)到45.05、45.79、46.20 mg/mL，平均值為45.68 mg/mL。試驗(yàn)值與模擬值基本一致，表明該優(yōu)化模型有較高的可靠性。

2.4 蘆葦酶水解過(guò)程產(chǎn)物分析

由圖2可以看出，對(duì)蘆葦酶水解過(guò)程的產(chǎn)物進(jìn)行分析，0～8 h總還原糖濃度快速升高，反應(yīng)進(jìn)行到8 h時(shí)酶解液中總還原糖濃度達(dá)到最大值45.68 mg/mL，其后基本保持不變。HPLC檢測(cè)糖化液組分，結(jié)果表明，糖化液中葡萄糖濃度最高為21.36 mg/mL，其次為木糖16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖含量較少。隨著糖化時(shí)間的增加，葡萄糖、木糖含量的變化趨勢(shì)與總還原糖濃度的變化趨勢(shì)相似，阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖含量在整個(gè)反應(yīng)測(cè)定的時(shí)間段內(nèi)變化不大。

3 小結(jié)

本研究在前期蒸氣爆破預(yù)處理試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，基于Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)影響蘆葦糖化的因素重要性進(jìn)行篩選，獲得影響蘆葦糖化的最重要的三個(gè)因素為H2SO4濃度、Tween-80添加量和MnSO4添加量；進(jìn)一步應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總還原糖濃度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立工藝數(shù)學(xué)模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了工藝優(yōu)化模擬。結(jié)果表明，H2SO4濃度和MnSO4添加量是影響蘆葦糖化的重要因素。最佳工藝條件為H2SO4濃度0.88%，Tween-80添加量0.61%，MnSO4添加量0.26%，糖化時(shí)間僅需8～10 h，總還原糖濃度達(dá)到最大值45.68 mg/mL，試驗(yàn)值與模擬值基本一致，表明該優(yōu)化模型有較好的可靠性，具有一定的指導(dǎo)意義。液相色譜分析表明，糖化液中糖種類(lèi)主要為葡萄糖和木糖，其含量分別為21.36、16.62 mg/mL，還含有少量的阿拉伯糖、纖維二糖和半乳糖。

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