艾地云 張騰飛 汪宏才 羅玲 王紅琳 溫國元 羅青平 張蓉蓉 邵華斌

摘要：對湖北省宜昌市某雞場送檢的6只病雞進行了病理剖檢、球蟲糞檢及病原菌的分離鑒定試驗。剖檢病雞可見小腸、盲腸脹氣，小腸黏膜增厚、潰瘍、有散在出血點，盲腸內(nèi)有血色稀便；盲腸糞便涂片鏡檢可見大量球蟲卵囊；從小腸內(nèi)容物中分離鑒定到A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）。結(jié)合臨床癥狀，診斷該起病例為雞壞死性腸炎與球蟲的混合感染。

關鍵詞：蛋雞；雞壞死性腸炎；球蟲??；產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）；診斷與治療

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5345-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.035

Diagnosis and Treatment of Necrotic Enteritis and Coccidiosis Co-infection

in Roman Powder Laying Hens

AI Di-yun，ZHANG Ten-fei，WANG Hong-cai，LUO Ling，WANG Hong-lin，WEN guo-yuan，

LUO Qing-ping，ZHANG Rong-rong，SHAO Hua-bin

（Institute of Animal and Veterinary Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： In June 2014，more than 200 Roman powder laying hens with only 63 day-old were dead because of the outbreak of an acute deaths in Yichang， Hubei.The hens were apathetic， loss of appetite， and steak dark red thin stool. In order to diagnose the desease， To send the samples of 6 sick chicken pathologic autopsy， coccidium droppings inspection， separation and identification of pathogenic bacteria.Results show that the autopsy sick chicken intestine and caecum bilge gas， thickening of the small intestinal mucosa， ulcers， there are a lot of pinpoint petechiae， appendix there were bloody stools. Appendix feces smear microscopy is a lot of chicken ball egg sac. From the small intestine contents identification to type A Clostridium perfringens.It was confirmed that the cases were caused by necrotic enteritis and coccidiosis mixed infection according to above-mentioned laboratory test results and clinical symptoms.

Key words： laying hens； necrotic enteritis； coccidium； Clostridium perfringens； diagnosis and treatment

雞壞死性腸炎（Necrotic enteritis，NE）又稱腸毒血癥、爛腸癥，由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的一種以侵害雞腸道，引起腸道出血、潰瘍、壞死為主要特征的疾病[1，2]。雞球蟲?。–occidiosis）是雞常見的一種急性流行性原蟲病，以消瘦、貧血、血痢、生長發(fā)育受阻為特征[1]。雞壞死性腸炎常與小腸球蟲病并發(fā)或繼發(fā)，呈全球流行態(tài)勢，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[3-5]。

2014年6月，湖北省宜昌市某雞場散養(yǎng)的1萬多只63日齡羅曼粉蛋雞發(fā)病，病雞在臨床上出現(xiàn)精神萎糜、食欲不振、羽毛蓬亂、下痢、排暗紅色稀便等臨床癥狀。通過對病雞樣品的病理剖檢、產(chǎn)氣夾膜梭菌的分離鑒定、球蟲糞檢，結(jié)合臨床癥狀，診斷該起病例為雞壞死性腸炎與球蟲病混合感染所致，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 湖北宜昌市某雞場送檢的6只63日齡發(fā)病的羅曼粉蛋雞。

1.1.2 培養(yǎng)基 CW瓊脂基礎（含卡那霉素）、50%卵黃鹽水懸液為青島日水生物技術有限公司產(chǎn)品；含卡那霉素、卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基按使用說明書自制；細菌微量生化反應管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 參考菌株 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C57-12株）、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C59-37株）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞源大腸桿菌由本研究室分離保存。

1.1.4 引物設計 PCR特異引物序列參照文獻[5]，由生工生物工程（上海）有限公司合成，α-毒素基因、β-毒素基因預期片段分別為402、196 bp。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢 解剖病雞觀察其病理變化。

1.2.2 球蟲糞檢 采用飽和鹽水漂浮法。取5～10 g盲腸糞便于燒杯中，加入飽和鹽水攪拌、過濾，將濾液倒入直徑1.5～2.0 cm的試管中至液面凸出管口，上放蓋玻片，靜置30 min，平移此蓋玻片至有一滴甘油的載玻片上，顯微鏡下觀察球蟲卵囊。

1.2.3 細菌的分離與鑒定 取小腸內(nèi)糞便少許，接種于CW瓊脂培養(yǎng)基，42 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，選取單個疑似菌落接種于紫牛乳培養(yǎng)液中，42 ℃，厭氧培養(yǎng)6～9 h。選取單個疑似菌落涂片，革蘭氏染色、鏡檢。并分別接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、明膠、甘露醇、H2S、硝酸鹽還原、蛋白胨水微量生化反應管，進行生化鑒定。

采用多重PCR法鑒定細菌毒素基因型[5]。用煮沸法抽提已分離鑒定的產(chǎn)氣莢膜梭菌及參考菌株的模板DNA。反應體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 1.0 μL（10 mmoL/L），上、下游引物各1.0 μL（10 mol/L），Taq DNA聚合酶2.5 U，模板10 μL，用滅菌去離子水補足至50 μL。反應程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴增的基因片段進行測序分析，PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢

病雞剖檢可見小腸脹氣，腸壁增厚，腸管剪開后自行外翻，黏膜上有斑狀潰瘍及散在出血點，盲腸高度脹氣、呈暗紅色、盲腸內(nèi)有血色稀便。

2.2 球蟲糞檢

病雞盲腸糞便鏡檢可發(fā)現(xiàn)大量約20 μm×15 μm大小的長卵圓形球蟲卵囊。

2.3 細菌的分離與鑒定

2.3.1 菌落形態(tài) 經(jīng)CW瓊脂培養(yǎng)可見圓形、微隆起、卵黃色、表面褶皺、菌落周圍形成白濁環(huán)、中等大小的疑似菌落生長。

2.2.2 紫牛乳反應 分離菌株的紫牛乳反應均呈陽性，出現(xiàn)爆裂發(fā)酵現(xiàn)象，此試驗對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有特征性的鑒別意義。

2.3.3 細菌形態(tài)觀察 分離菌株經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下觀察均可見大量，長4～8 μm，寬1.0～1.4 μm，單在、成雙呈短鏈狀的兩端鈍圓的革蘭陽性、有莢膜的粗大桿菌。

2.3.4 生化試驗 分離菌株葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、明膠、H2S、硝酸鹽還原均呈陽性反應，甘露醇、吲哚均呈陰性反應。

根據(jù)分離菌株的菌落形態(tài)、紫牛乳反應、細菌形態(tài)、生化試驗結(jié)果均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌特性，說明分離菌株均為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3.5 細菌毒素基因型鑒定 多重PCR反應結(jié)果顯示，從分離菌株中均可擴增出α-毒素基因片段（長度402 bp），與預期擴增的基因片段大小一致；均沒有擴增出β-毒素基因片段（長度196 bp），見圖1。擴增出的α-毒素基因片段序列測定結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素基因序列同源性達到99%。說明6株分離菌株毒素基因分型結(jié)果均為A型。

根據(jù)病雞的剖檢病理變化、球蟲糞檢及產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀、診斷該雞群混合感染壞死性腸炎和球蟲病。

3 討論

山地放養(yǎng)雞易感染球蟲導致腸黏膜損傷，而產(chǎn)氣莢膜梭菌是條件致病菌，小腸粘膜損傷是重要的誘發(fā)因素，所以臨床上常見雞球蟲病與壞死性腸炎混合感染[1，3，4]。雞壞死性腸炎與球蟲病一年四季皆有發(fā)生，但在氣溫多變、高溫潮濕的夏秋季節(jié)發(fā)生較多。

雞壞死性腸炎的病原為A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，目前湖北省內(nèi)皆為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，與文獻報道[2]的中國其他省份一致。球蟲病腸道的病理變化和部位與球蟲的種類有關，該起病例為毒害艾美爾球蟲，主要為害十二指腸和小腸的中段[1，6]。

目前主要用藥物防治雞壞死性腸炎、球蟲病，產(chǎn)氣加膜梭菌及雞球蟲易產(chǎn)生耐藥性，應定期輪換用藥。雞球蟲病還可采用疫苗進行預防，但雞球蟲種類多，免疫球蟲弱毒苗有一定效果，但有時未能提供堅強的保護。在飼料中添加益生素、酶制劑及中草藥制劑可提高雞腸道的健康狀況，能一定程度預防該病[7-9]。

該起病例用抗球蟲藥及林可霉素、青霉素、酒石酸泰樂菌素抗菌藥飲水5 d，療效顯著。

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