張興會，郭祉岐，郭　丹，王家明，趙艷嬌，鄒麗娜

（1．遼寧省畜牧科學研究院，遼陽 111000；2.遼寧省遼陽市白塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理中心）

血小板計數(shù)法在絨山羊超早期妊娠診斷上的應用

張興會1，郭祉岐2，郭丹1，王家明1，趙艷嬌1，鄒麗娜1

（1．遼寧省畜牧科學研究院，遼陽 111000；2.遼寧省遼陽市白塔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理中心）

選擇67只同期發(fā)情的絨山羊母羊，人工授精輸配28只（試驗Ⅰ組），胚胎移植31只（試驗Ⅱ組），未受配母羊8只（對照組）。采用血小板計數(shù)法對59只受配和移植后母羊進行早期妊娠診斷。結(jié)果顯示，在發(fā)情后第7天，懷孕母羊血小板數(shù)值分別降低（63±51.71）×109個/L和（55±32.90）×109個/L，與未配種對照母羊血小板值相比，差異極顯著（P＜0.01）；胚胎移植后未孕羊的血小板記數(shù)值在發(fā)情當天和第7天相差（29±22.56）×109個/L，與對照組差異顯著（P＜0.05），與胚胎移植妊娠羊之間比較差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)與臨床妊娠檢查及產(chǎn)羔結(jié)果比較：配種羊妊娠符合率91.30%，未孕羊符合率80.00%，總符合率89.29%；胚移植妊娠羊符合率38.46%，未孕羊符合率77.78%，總符合率61.29%。

血小板計數(shù)；絨山羊；超早期妊娠診斷；胚胎移植

早期妊娠診斷技術(shù)是絨山羊新品系快繁生產(chǎn)管理上的一項重要內(nèi)容，通過該項技術(shù)可以在母羊懷孕早期，快速準確檢測母羊是否懷孕，這對于保胎、縮短胎次間隔、提高繁殖力和經(jīng)濟效益具有重要意義。遼寧省畜牧科學研究院與遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司正在探索和應用小母羊早期利用的快繁技術(shù)，即研究應用幼羔早期超排、體外培養(yǎng)、體外受精、胚胎移植等技術(shù)，而胚胎移植后的早期胚胎丟失，一直是制約該技術(shù)應用的瓶頸問題。運用血小板計數(shù)法對綿羊進行超早期妊娠診斷在國內(nèi)已有報道［1］，且尚未見該方法應用于絨山羊方面的報道。本研究以遼寧絨山羊為研究對象，旨在找出一種絨山羊超早期妊娠診斷方法，同時對分析胚胎移植后母體與孕體間發(fā)生排斥的關(guān)鍵期，為提高胚胎移植產(chǎn)羔率，提供生殖基礎(chǔ)支持。

1　材料和方法

1.1試驗動物

1.1.1試驗羊選擇 選取遼寧絨山羊科技示范場的3～8歲經(jīng)產(chǎn)、空懷母羊74只，供試羊采取舍飼方式，營養(yǎng)狀態(tài)良好，發(fā)育及繁殖史正常，無臨床可見疾病。

1.1.2試驗羊處理采取孕酮栓（CIDR）+孕馬血清（PMSG）同期發(fā)情方案處理試驗羊，其中67只發(fā)情，分3組：28只發(fā)情羊鮮精人工授精（試驗Ⅰ組）、31只在發(fā)情后54～64 h進行體外胚的移植手術(shù)（試驗Ⅱ組）、8只發(fā)情羊不做處理（對照組）。

1.2儀器與試劑

生物顯微鏡，針頭，血球記數(shù)板，沙利氏吸管，小試管，血小板稀釋液，枸櫞酸鈉，尿素，福爾馬林。

1.3方法

制取血小板稀釋液，過濾后置于冰箱內(nèi)。對8只發(fā)情后未配種的試驗羊在發(fā)情后的第0天和第7天分別用10號針頭頸靜脈采血2～3 mL，放入預先加有抗凝劑的青霉素瓶內(nèi)，搖勻。然后用沙利氏吸管從中吸取20 μL血液，加入盛有0.4 mL血小板稀釋液的小試管內(nèi)，輕輕搖勻。靜置10 min后，吸取一滴充入血小板記數(shù)室內(nèi)，靜置10 min，在高倍鏡下進行血小板記數(shù)；對28只受配母羊和31只移植羊采用同種方法，進行2次血小板計數(shù)，第1次在發(fā)情當天，第2次在配種或移植后7 d。以配種后7 d檢測血小板值，分別降低63×109個/L和55×109個/L以上的母羊為妊娠羊，否則判定為未孕。判定實際妊娠與血小板計數(shù)法診斷的符合率。將該方法測定的結(jié)果與試驗母羊發(fā)情后45 d左右的臨床妊娠診斷及之后的產(chǎn)羔結(jié)果進行比較后，統(tǒng)計羊妊娠符合率、未孕符合率和總符合率，作為下一步試驗判定母羊妊娠與否的標準［2］。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對檢測數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2　結(jié)果與分析

由表1可知，試驗中23只人工授精后的妊娠羊，發(fā)情時血小板的記數(shù)（379±50.03）×109個/L，第7天下降到（316±61.81）×109個/L，差值（63±51.71）×109個/L，與對照組比較，差異極顯著（P＜0.01）；13只胚胎移植的妊娠羊，在發(fā)情當日血小板數(shù)（404±35.14）×109個/L，第7天血小板數(shù)下降到（349±48.06）×109個/L，差值（55±32.90）×109個/L，與對照組比較，差異也極顯著（P＜0.01）；人工授精后未孕羊的血小板差值與對照比較差異不顯著（P＞0.05）。根據(jù)配種前后血小板數(shù)的變化規(guī)律，以配種后第7天血小板值與發(fā)情時血小板值之差大于55×109個/L為診斷妊娠的標準。胚胎移植后未孕羊血小板差值與對照組（空懷羊）差異顯著（P＜0.05）、與胚胎移植后妊娠羊血小板差值比較差異不顯著（P＞0.05）。表明用血小板記數(shù)法不能區(qū)分胚胎移植羊是否妊娠。

表1　試驗母羊的血小板計數(shù)值　×109個/L

由表2可知，利用血小板計數(shù)法，測得配種羊妊娠符合率91.30%，未孕羊符合率80.00%；胚胎移植后妊娠羊的符合率38.46%，未孕羊的符合率77.78%。應用血小板計數(shù)的差額值，推測胚胎移植后妊娠羊為13只，而2個月妊娠診斷實際受孕為5只，這說明有近40%（13/31）移植的受體羊，體外胚在體內(nèi)可以發(fā)育到桑囊胚階段。

表2　血小板計數(shù)法與實際妊娠情況的結(jié)果比較

3　討論與結(jié)論

1）采用血小板計數(shù)法進行早孕診斷，其技術(shù)原理是血小板數(shù)量受著床前胚胎釋放的一種中性類脂影響［3］，血小板活化因子（PAF）能引起血小板凝集，降低外周血小板數(shù)量。利用這一原理，設(shè)計出本次試驗的檢測方法，用于超早孕臨床的診斷。從結(jié)果可知，受孕羊第7天采血檢測的血小板數(shù)顯著減少，這可能是PAF所致。據(jù)報道，PAF能介導妊娠小鼠對胚胎的識別，繼而引發(fā)血小板數(shù)減少，表現(xiàn)出妊娠的生理指標，桑椹胚期間分泌的PAF的含量較大，未受孕鼠則無該現(xiàn)象。綿羊的桑葚胚的形成大約在受精后的第7天。據(jù)報道多浪羊在配后第7天所測血小板值較配種時的差值大于70×109個/L，可確定為妊娠［4］。該次試驗中檢測結(jié)果與上述報道相吻合，血小板下降值為60×109個/L，絨山羊和綿羊生理基數(shù)不同，可能導致兩者差值間有一定間距。由此可見，在配種后第7天采血檢測血小板數(shù)的變化，也適用于絨山羊的超早期妊娠診斷。

2）采用血小板計數(shù)法進行早孕診斷的技術(shù)優(yōu)勢與早孕相關(guān)的血小板數(shù)減少，是母體對妊娠做出的最初的全身性反應，而且是各種動物僅有的早孕性生理變化。采用該方法對絨山羊進行超早孕診斷，不僅測定容易，且準確性也很高。試驗中28只配種母羊血液檢測，妊娠符合率和未孕的符合率分別達90.48%和80.00%，總符合率為82.41%。因此，采用該方法進行母羊的早期妊娠診斷具有診斷時間超早、診斷相對準確率高、簡單易行等優(yōu)勢。

3）由于存在一定比例的胚胎早期死亡現(xiàn)象，因此在進行超早孕診斷為妊娠后，不排除之后又發(fā)生隱性流產(chǎn)的可能性，從胚胎移植羊血小板計數(shù)的結(jié)果判斷受胎率為38.46%，而實際受胎率為16.13%（5/31），就表明胚胎存在早期死亡或著床階段出現(xiàn)問題。這在血小板計數(shù)法診斷結(jié)果的后期統(tǒng)計和分析中，應作為需要預計到的因素。試驗中人工授精羊出現(xiàn)2只、胚胎移植羊出現(xiàn)6只母羊發(fā)情期過后又出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象，血小板值第7天檢測也有明顯降低現(xiàn)象，這可能是隱性流產(chǎn)影響所致［5］。此外，絨山羊血小板數(shù)減少也可能是一些疾病所導致的，如貧血、白血病、肝硬化等，因此在早期妊娠診斷時也應考慮和排除這些因素的干擾。

總之，本試驗研究表明，血小板記數(shù)法對絨山羊進行超早期妊娠診斷具有時間早，方法簡單、準確等優(yōu)點。因未對發(fā)情7 d至45 d的母羊做相應的妊娠診斷，胚胎移植中未孕羊胚胎丟失所發(fā)生的階段尚不能作定論。由于本試驗樣本數(shù)較少，可能造成誤差，因此此診斷方法的可行性還有待進一步探討。

［1］ 王念功，馬群山，王忠志，等.應用早孕相關(guān)性血小板減少對母羊進行超早期妊娠診斷的研究［J］.內(nèi)蒙古畜牧科學，1993，14（2）：23-25.

［2］ 李玉飛，陳繼先，楊世軍，等.根據(jù)血小板數(shù)的變化對豬進行超早期妊娠診斷的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1996（2）：11-15.

［3］ 胡承閱，汪竟成，馬麗如，等.胚源性血小板活化因子（EDPAF）及其生理和臨床意義［J］.國外醫(yī)學：計劃生育分冊，1989（2）：83-85.

［4］ 夏爽，李勤凡，熱孜宛古麗·買買提，等.采用血小板計數(shù)法對綿羊進行超早期妊娠診斷研究［J］.畜牧與飼料科學，2012，33（4）：19-20.

［5］ 張家驊.反芻動物妊娠識別及早期胚胎死亡［J］.中國獸醫(yī)雜志，1994（2）：47-48.

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張興會（1972-），男，高級畜牧師，碩士。