于楓 徐海濱 張達 侯振中 田文儒

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熱應激對雌鼠卵巢內(nèi)酶代謝的影響

于楓①③徐海濱③張達④侯振中①田文儒*②

（①東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 哈爾濱 150030 ②萊陽農(nóng)學院 山東萊陽 ③山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 濰坊 ④黑龍江大學 哈爾濱）

研究熱應激條件下，卵巢中谷胱甘肽(GSH)、ATP酶、乳酸脫氫酶(LDH)含量的變化，從而評定熱應激對雌性動物卵巢的損傷程度。試驗將雌鼠分為6個處理組：37℃ 1h、37℃ 2h、39℃ 1h、39℃ 2h、41℃ 1h、41℃ 2h，連續(xù)7d進行熱應激，測定小鼠卵巢GSH、ATP、LDH的含量。結(jié)果表明：熱應激后，小鼠卵巢中GSH、ATP酶含量在37℃ 2h時開始下降，隨著溫度的升高和時間的延長這兩種酶的含量呈減少的趨勢。LDH含量在39℃開始升高，且隨著應激強度增強而增多。從而說明卵巢開始出現(xiàn)損傷是從37℃(2h)開始，隨著熱應激溫度升高和時間的延長，卵巢的受損傷程度升高。

小鼠 熱應激 GSH ATP LDH

隨著全球氣候溫室效應的不斷加劇，全球變暖，作為最重要環(huán)境應激因素的熱應激越來越引起人們的關(guān)注，主要原因是熱應激對各種動物尤其是經(jīng)濟動物有很大的影響，損害了養(yǎng)殖戶的利益，嚴重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

酶是動物進行新陳代謝的催化劑，對動物體內(nèi)的多種化學反應起重要作用。但是在熱應激狀態(tài)下，動物的代謝系統(tǒng)受到干擾，造成了血清中酶的活性和含量發(fā)生變化。國內(nèi)外許多學者報道了高溫熱應激對動物機體內(nèi)各種酶的影響。

目前，國內(nèi)對熱應激時酶變化的研究側(cè)重于血液中各種酶，對自由基研究著重于肝損傷和心臟缺血再灌注時自由基的清除，對能量代謝研究著眼于心肌和肝在熱應激時的能量變化，而對在繁殖中占有重要地位的卵巢在應激時上述變化的研究卻很少見報道。而卵巢機體受到應激時的變化卻是至關(guān)重要的，如果卵巢機能減退，將會影響排卵。因此本試驗將熱應激應用到活體雌鼠上，揭示熱應激主要生殖器官的卵巢的能量代謝及清除自由基的變化，評定熱應激對雌性動物卵巢的損傷程度。為其他應激對生殖器官損傷的研究提供模型。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及熱休克處理 昆明系健康小鼠(已達性成熟，體重在25±0.5g)由實驗室自繁自養(yǎng)，隨機分為對照組和實驗組。對照組常規(guī)條件下飼養(yǎng)(25℃)。通過熱應激后小鼠的行為表現(xiàn)、肛溫、半數(shù)致死量(熱應激引起)確立熱應激的強度為37℃1h、37℃2h、39℃1h、39℃2h、41℃1h、41℃2h。將實驗組放置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)(通氣良好，濕度與外界保持一致)，自由采食和飲水，按照確立的熱應激溫度和時間進行處理，每隔10min觀察箱內(nèi)小鼠活動情況。連續(xù)處理7d。

1.2 小鼠卵巢的處理 將上述處理的小白鼠于第8日剖殺，收集的卵巢放入生理鹽水中清洗干凈，超聲破碎，分裝，-70℃凍存，待檢。

1.3 GSH、LDH、ATP酶的測定 檢測試劑盒購自南京建成，具體檢測方法按三種測定試劑盒要求進行。

2 結(jié)果

2.1 小白鼠熱應激后GSH含量變化 按照實驗設(shè)計的處理方法，小鼠熱應激后卵巢中GSH的測量結(jié)果見表1。

表1 熱應激小鼠卵巢GSH變化 (mg/ml)

將表中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，可以得出，卵巢中GSH 的變化情況是：37℃(1h)熱應激處理組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，37℃(2h)熱應激處理組與對照組間差異顯著(P<0.05)，39℃熱應激處理組與對照組間差異顯著(P<0.05)，41℃熱應激處理組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；在相同處理時間內(nèi)，37℃處理組與39℃處理組相比差異顯著(P<0.05)，39℃處理組與41℃處理組相比差異顯著(P<0.05)，37℃處理組于41℃處理組間差異極顯著(P<0.01)；在相同處理溫度內(nèi)，不同處理時間組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 小白鼠熱應激后卵巢中Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-AT酶含量變化

表2 熱應激小鼠卵巢中Ca++Mg++-ATP酶和Na+K+-ATP酶變化(μmol/mgprot/h)

（1）將表2中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，可以得出，卵巢中Ca++Mg++-ATP酶的變化情況是：37℃ 1h熱應激處理組與對照組間差異不顯著(P>0.05)，37℃ 2h熱應激處理組與對照組間差異顯著(P>0.05)，39℃熱應激組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，41℃處理組與對照組相比差異極顯著(P< 0.01)；相同處理時間內(nèi)，37℃處理組與39℃處理組間差異顯著(P<0.05)，39℃處理組與41℃處理組間差異顯著(P<0.05)，37℃處理組與41℃處理組間差異極顯著(P<0.01)；相同處理溫度，不同處理時間組間差異顯著(P< 0.05)。（2）卵巢中Na+K+-ATP酶的變化情況是：37℃(1h)熱應激處理組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，37℃(2h)熱應激處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，39℃、41℃處理組與對照組間差異極顯著(P<0.01)；相同處理時間內(nèi)，37℃處理組與39℃處理組間差異顯著(P<0.05)，37℃處理組與41℃處理組間差異顯著(P<0.05)，39℃處理組與41℃處理組間差異顯著(P<0.05)；相同處理溫度，不同處理時間組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 小白鼠熱應激后卵巢中LDH含量變化

表3 熱應激小鼠卵巢中LDH含量變化 (U/gprot)

37℃熱應激處理組與對照組相比較差異不顯著，39℃熱應激處理組與對照組間差異顯著(P<0.05)，41℃熱應激處理組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；在相同處理時間內(nèi)，37℃處理組與39℃處理組相比差異顯著(P< 0.05)，39℃處理組與41℃處理組相比差異顯著(P<0.05)，37℃處理組于41℃處理組間差異極顯著(P<0.01)；在相同處理溫度內(nèi)，不同處理時間組間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 熱應激對小鼠卵巢GSH含量的影響 GSH是機體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)中的一個重要物質(zhì)(Ando M，1994)，因為它不僅能在酶的催化下和脂質(zhì)過氧化物反應抑制自由基的形成，而且可和自由基直接反應使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定分子，它通過自身巰基與自由基結(jié)合，從而清除生物體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基，維持細胞的正常的生長，保護細胞內(nèi)含巰基酶的活性(如ATP酶)，防止由于巰基的氧化而導致蛋白質(zhì)的變性，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。從表1中可以看出，卵巢中，37℃(1h)處理組GSH的活性與正常對照組相比并沒有發(fā)生明顯變化，這是因為機體在正常情況下也會產(chǎn)生自由基，而37℃接近于動物體自身的溫度，且應激時間不長，所以機體自由基的產(chǎn)生并未明顯增多，因此，不需要過多動用GSH來清除自由基。從37℃(2h)開始，GSH含量開始明顯減少，說明隨著應激程度的增大，卵巢中產(chǎn)生了自由基，機體動用GSH來清除自由基。而在相同時間內(nèi)，隨著應激強度的加大，GSH的含量降低的幅度增大，說明隨著應激強度的增大，機體產(chǎn)生的自由基增多，因此機體為了清除自由基來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，消耗GSH的量增加。在相同處理溫度內(nèi)，GSH的量與應激時間成負相關(guān)的趨勢，隨著應激時間的延長，GSH消耗量減少，這說明，應激時間的延長，機體產(chǎn)生的自由基也增多，所以GSH的消耗量也就相應增多。表1還可以說明，應激強度越大，應激時間越長，GSH的消耗就越多，這是因為還原型的GSH被氧化成氧化型的GSSG。機體正常情況下GSH和GSSG的比值處于一個穩(wěn)態(tài)，GSH/GSSG的穩(wěn)態(tài)是維持細胞正常生理過程的關(guān)鍵(Harris C.et al，1993)，同時它也是細胞內(nèi)最重要的抗氧化系統(tǒng)之一。隨著GSH含量的下降，GSSG含量的升高，GSH/GSSG的比值升高，說明機體處于較高應激狀態(tài)。同時也說明隨著時間的延長和溫度的升高，卵巢的受損傷程度成升高趨勢。

3.2 小白鼠熱應激后卵巢Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-ATP酶含量變化 ATP酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種酶，主要存在于組織細胞及細胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它的功能主要是維持細胞內(nèi)外的離子及滲透壓平衡、跨膜電化學和細胞的能量代謝。Na+K+-ATP酶是鑲嵌在質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子層中的一種蛋白質(zhì)，具有載體和酶的活性。它催化ATP水解，提供能量驅(qū)動Na+和K+對向運輸，使細胞內(nèi)蓄積高濃度的K+，而細胞外則為高濃度的Na+狀態(tài)，這是許多代謝反應進行的必備條件。鈣鎂三磷酸腺苷酶(Ca++Mg++-ATP酶)通過分解ATP供能，對調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有重要作用。從表2可以看出，37℃熱應激1h時，卵巢中Ca++Mg++-ATP酶的活性與正常對照組相比并沒有發(fā)生明顯變化，Na+K+-ATP酶的活性與對照組相比也未發(fā)生明顯變化，這是因為，37℃接近動物的體溫，屬于較為溫和的刺激，并且應激1h可能不足以使其發(fā)生變化，卵巢細胞并沒有受到嚴重損傷，所以ATP酶的代謝并沒有受到影響；而從37℃2h開始，Ca++Mg++-ATP酶的活性、Na+K+-ATP酶活性與對照組相比明顯降低，這是因為高溫改變了細胞膜的性狀，細胞逐漸受到破壞，影響到酶的代謝，一些研究已經(jīng)證實，細胞熱應激損傷的首發(fā)部位是細胞質(zhì)膜。推測機體高熱可使細胞膜的流動性發(fā)生變化，從而導致細胞質(zhì)膜穩(wěn)定下降，影響膜上結(jié)合蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其生物功能。同時，在熱應激中產(chǎn)生大量的自由基，這點可從本實驗中GSH含量的變化得出，自由基攻擊細胞膜，自由基與酶蛋白發(fā)生共價鍵結(jié)合或酶含巰基的氨基酸氧化致酶結(jié)構(gòu)變化，降低膜的流動性。Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-ATP酶都是膜結(jié)合蛋白，因此，細胞膜的損傷導致了Ca++Mg++-ATP、Na+K+-ATP酶活力的降低；而在39℃處理溫度下，這兩種酶與對照組相比變化程度不一致，是因為熱應激時，Na+K+-ATP酶的活性與膜脂流動性特別是膜內(nèi)流動性成正相關(guān)，這與姜振(2004)的報道相一致；而Ca++Mg++-ATP酶活性與脂質(zhì)過氧化之間存在聯(lián)系，其機理可能是脂質(zhì)過氧化損傷細胞膜結(jié)構(gòu)或抑制其呼吸功能而影響Ca++Mg++-ATP酶活性，這與湯平濤等（1998）的報道相一致。Na+K+-ATP酶活性比Ca++Mg++-ATP酶活力下降更為明顯，可能是因為Na+、K+在細胞膜內(nèi)外的濃度差要比Ca++、Mg++在細胞膜內(nèi)外的濃度差大的緣故。在相同時間內(nèi)，隨著應激強度的增加，卵巢Ca++Mg++-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活力下降幅度增大，在相同處理溫度內(nèi)，隨著時間的延長，卵巢Ca++Mg++-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活力下降幅度增大，主要是因為隨著應激強度的加大，應激時間的延長，細胞膜受到的破壞程度增大，因此酶與細胞膜結(jié)合的程度下降，而導致酶活性下降幅度增大。從表2可以看出，隨著熱應激強度和應激時間的延長，卵巢中ATP酶的活性降低，ATP的分解減少，導致卵巢的供能減少，最后必將影響卵巢的正常生理功能。

3.3 小白鼠熱應激后卵巢中LDH含量變化 LDH存在于人體各組織器官中。LDH是機體能量代謝中的一種重要酶，是糖代謝中催化丙酮酸向酵解方向的終產(chǎn)物乳酸轉(zhuǎn)化的酶，動物體內(nèi)LDH可使乳酸脫氫生成丙酮酸，也可使丙酮酸還原成乳酸。在厭氧酵解時，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下形成乳酸，它可緩解體內(nèi)能量不足。從表3可以看出37℃處理組的卵巢的LDH含量與對照組相比并沒明顯的變(P>0.05)，這是因為在37℃時，機體內(nèi)的氧并沒有大量消耗，因此機體內(nèi)糖代謝的途徑依然是以有氧氧化為主；而從39℃開始處理組與對照組相比變化明顯，并且在相同處理時間內(nèi)，LDH含量隨應激強度的加大而升高，主要是因為隨著熱應激強度的加大，引起機體呼吸和血液循環(huán)速率加快，以及氧和能量的大量消耗，因此細胞能量代謝方式和途徑的改變也必然會影響其正常生命活動的進行。熱應激時，糖代謝途徑以產(chǎn)生大量能量的有氧氧化向無氧酵解方向轉(zhuǎn)移，因此首先要保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟等重要器官的供氧，其他組織極可能在缺氧情況下采取無氧酵解方式供能。這樣既保證機體能量需要又不過度增加機體散熱。而在相同處理溫度，不同處理時間組間LDH含量變化明顯，這說明，隨著應激時間時間的延長，機體的耗氧量增加，另外由于循環(huán)障礙也可造成組織供氧不足，因此，糖酵解加強。隨著糖酵解作用的加強，一方面產(chǎn)生大量乳酸，可引起酸中毒等變化；另一方面可影響其他物質(zhì)代謝和造成體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的大量消耗，甚至引起機體消瘦、各組織器官激能活動和機體抵抗力降低。LDH變化也就在一定程度上反應處卵巢受損的情況。

結(jié)論：在37℃熱應激處理2h后，小鼠卵巢中GSH含量、ATP酶含量時開始下降，且隨著應激強度增強而下降。LDH含量在39℃開始升高，且隨著應激強度增強而升高。卵巢出現(xiàn)受損是從37℃熱應激2h開始。至于其它低于37℃的溫度是否會導致卵巢出現(xiàn)損傷，由于試驗的限制未曾證實，留待以后繼續(xù)探討。

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（2015–04–16）

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