彭 雙，王一明，林先貴*（1.中國科學(xué)院南京土壤研究所，土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008；2.中國科學(xué)院南京土壤研究所-香港浸會大學(xué)土壤與環(huán)境聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008）

連續(xù)施用發(fā)酵豬糞對土壤中四環(huán)素抗性基因數(shù)量的影響

彭 雙1，2，王一明1，2，林先貴1，2*（1.中國科學(xué)院南京土壤研究所，土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008；2.中國科學(xué)院南京土壤研究所-香港浸會大學(xué)土壤與環(huán)境聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008）

為了研究連續(xù)施用發(fā)酵豬糞之后，土壤中抗性基因的數(shù)量以及發(fā)酵豬糞的施用量對土壤抗性基因的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對稻麥輪作模式下連續(xù)6年施用4.5t/hm2和9.0t/hm2發(fā)酵豬糞的土壤進(jìn)行了四環(huán)素抗性基因（TRGs）的檢測和定量分析.在施用發(fā)酵豬糞的土壤中能夠檢測到9種TRGs.施用發(fā)酵豬糞顯著增加了土壤中tetG、tetL、tetB（P）、tetO、tetW的絕對數(shù)量，其中tetB（P）、tetW、tetO的絕對數(shù)量受到了施肥用量的影響；而tetZ、tetC和tetS的絕對數(shù)量則沒有受到施肥的影響.上述8種TRGs在同一施肥處理的0～5cm、5～10cm以及10～20cm土壤中的相對豐度分布均無顯著差異.發(fā)酵豬糞的施用也顯著增加了tetG、tetL、tetB（P）和tetO的相對豐度，但是僅有tetO的相對豐度受到了施肥用量的顯著影響.本研究表明，在稻麥輪作模式下，農(nóng)田土壤中的TRGs數(shù)量會受到發(fā)酵豬糞中殘留TRGs的影響，連續(xù)施用該糞肥會顯著增加土壤中tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數(shù)量和相對豐度.因此，需要優(yōu)化畜禽糞堆肥發(fā)酵工藝，以減少抗性基因在糞肥中的殘留.

四環(huán)素抗性基因；糞肥農(nóng)用；基因污染；耐藥性

近年來，由于濫用抗生素而導(dǎo)致大量耐藥性致病菌的出現(xiàn)引起了人們對抗生素及抗生素抗性基因（ARGs）擴(kuò)散的廣泛關(guān)注.ARGs在環(huán)境中的持久性殘留，以及在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播、擴(kuò)散可能比抗生素本身的環(huán)境危害更大［1］.越來越多的證據(jù)表明水產(chǎn)養(yǎng)殖、動物飼養(yǎng)、農(nóng)業(yè)施肥以及生活污水處理等人類活動促進(jìn)了抗生素抗性在環(huán)境中的傳播［2］.畜禽糞便中含有高水平的抗生素［3-4］、抗生素抗性微生物［5-7］、重金屬（與抗性基因之間有協(xié)同選擇作用）［8-9］和抗性基因［3，6-8］，其資源化利用過程中對環(huán)境造成的影響是目前越來越受關(guān)注的問題.

土壤是人類病原菌抗性基因的主要來源［10］，也是畜禽糞便消納的主要場所.因此，畜禽糞污染或者施用到土壤后對土壤抗性菌和抗性基因的影響也是當(dāng)前抗性擴(kuò)散研究的熱點(diǎn)之一.一些研究者從不同的角度研究了畜禽糞肥施用對土壤抗性的影響.如Sengel?v等［11］發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌的四環(huán)素抗性水平可以在短期內(nèi)因豬糞漿的施加而上升，而且可以隨著豬糞漿施用量的增加而增加. Byrne-Bailey等［12］的研究結(jié)果表明施用豬糞會顯著增加土壤中可培養(yǎng)微生物對四環(huán)素和磺胺類抗生素的抗性水平，施用豬糞漿是影響土壤中四環(huán)素及磺胺類抗性基因豐度的重要因素［13］.

為了減少新鮮畜禽糞便中的有害物質(zhì)對環(huán)境的污染，工廠化堆肥發(fā)酵有機(jī)肥具有很大的應(yīng)用前景.研究表明，堆肥能夠顯著降低糞肥中殘留抗生素的濃度［14-16］，并且能夠降低其中的抗性基因含量［17-19］，是減少糞肥污染的一種方式［20-21］.目前，畜禽糞便發(fā)酵有機(jī)肥的施用越來越廣泛，但是關(guān)于畜禽發(fā)酵有機(jī)肥中殘留抗性基因的在土壤中的留存和污染能力；連續(xù)施用有機(jī)肥之后，農(nóng)田土壤中抗性基因的豐度；以及有機(jī)肥的施用量對土壤抗性基因的影響卻鮮有研究.

四環(huán)素類抗生素是目前使用最為廣泛的一種抗生素，自1953年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)四環(huán)素抗性基因（TRGs）以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的TRGs已達(dá)40多種［22］.跟多數(shù)抗性基因類似，TRGs一般通過5種方式起作用:編碼抗生素外排泵、編碼核糖體保護(hù)蛋白、編碼抗生素鈍化/降解酶、降低藥物的滲透性和靶向修飾.其中前2種是TRGs最主要的作用方式.目前，超過22種TRGs已經(jīng)在不同的環(huán)境樣品中被檢測到［23］.但是已有的研究多集中于養(yǎng)殖場周邊污染土壤以及新鮮或簡單漚制/儲存的糞便施用后的土壤，缺乏對于連續(xù)施用發(fā)酵糞肥后土壤中TRGs的定位觀測和研究.此外，稻麥輪作是江蘇省主要的農(nóng)作模式，而有關(guān)該模式下水稻土壤中TRGs的研究僅有零星報(bào)道.因此，本研究以中國科學(xué)院常熟農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站長期定位施用發(fā)酵豬糞試驗(yàn)地為平臺，靶標(biāo)在不同環(huán)境中被多次報(bào)道的23種TRGs，以期揭示在稻麥輪作模式下水稻土壤中的TRGs數(shù)量，以及連續(xù)施用不同重量的發(fā)酵豬糞對土壤TRGs的影響，為有機(jī)肥的生態(tài)施用提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究稻麥輪作模式下糞肥施用對土壤TRGs的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試發(fā)酵豬糞及施肥處理

供試的發(fā)酵豬糞（CM）來自江蘇常熟的某規(guī)模化養(yǎng)豬場附近的有機(jī)肥廠，該有機(jī)肥廠以養(yǎng)豬場豬糞為原料，經(jīng)過工廠化條垛式堆肥發(fā)酵制成商品有機(jī)肥（即發(fā)酵豬糞），該廠年產(chǎn)量3000～5000t.自2006年開始，在中國科學(xué)院常熟農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站的8塊試驗(yàn)田（30m2）分別進(jìn)行施肥處理，該試驗(yàn)田自實(shí)驗(yàn)站成立（1987年）以來無糞肥施用歷史.采用稻麥輪作的耕作方式，在稻麥插秧/播種前施肥，其中4塊試驗(yàn)田每季施用的發(fā)酵豬糞量為4.5t（干重）/hm2（記為LC），其余4塊施用9.0t（干重）/hm2的發(fā)酵豬糞（記為HC），并以實(shí)驗(yàn)站內(nèi)不施肥的4塊空地作為對照（記為CK）.本實(shí)驗(yàn)區(qū)土壤類型俗稱為烏柵土，中國土壤系統(tǒng)分類為潛育水耕人為土.發(fā)酵豬糞的基本性質(zhì)為pH 6.69、有機(jī)質(zhì)含量42.77%、全氮1.43%、全磷（P2O5）3.67%、全鉀（K2O）1.52%.土壤的基本性質(zhì)為pH 7.48、有機(jī)質(zhì)含量41.8g/kg、全氮1.9g/kg、全磷（P2O5） 2.7g/kg、全鉀（K2O） 21.4g/kg.

1.2 土樣的采集和保存

在2011年稻季末（施肥第6年），用直徑2cm的土鉆在各個(gè)試驗(yàn)田（HC、LC、CK）分別打6個(gè)孔，采集0～20cm土層的土壤樣品，將所取土樣分0～5cm、5～10cm以及10～20cm三層收集，挑出殘留的植物根系和石塊并混合均勻，4℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，-40℃冷凍保存待測.

1.3 發(fā)酵豬糞TRGs的檢測和鑒定

取-40℃保存的2011年插秧前施用的發(fā)酵豬糞樣品，提取總DNA，提取方法參照FastDNA?SPIN Kit for Faces （MP Biomedicals， Santa Ana，CA）試劑盒，用核酸蛋白質(zhì)分析儀NanoDrop ND-1000 （NanoDrop Technologies， Wilmington，DE）測定DNA濃度，-20℃保存待測.

用PCR方法對發(fā)酵豬糞中的TRGs進(jìn)行檢測，tet（B（P）、M、O、Q、S、T、W）和otrA所用的引物和PCR程序參考Aminov等［24］，tet（A、B、C、D、E、H、J、Y、Z、30）參考Aminov等［25］，tet（G、X、K）參考Ng等［26］，tetU和tetL分別參考Perreten等［27］和You等［28］.25μL的PCR體系中包括12.5μL的Premix EX TaqTMmixture （TaKaRa），2pmol的上下游引物，和大約150ng的模版DNA. 用2% （w/v）的瓊脂糖凝膠在1× TAE的電泳緩沖液中分析PCR產(chǎn)物，重復(fù)3次，以無菌蒸餾水為陰性對照.

將發(fā)酵豬糞中檢測到的TRGs PCR產(chǎn)物純化，并連接到pEASY-T3 （TransGen Biotech，Beijing）載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（詳細(xì)克隆步驟參見試劑盒說明書），通過藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取6～8個(gè)轉(zhuǎn)化子，用M13引物驗(yàn)證陽性，并將陽性轉(zhuǎn)化子保存于含有0.1g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中（將培養(yǎng)液與滅菌的80%甘油混合后在-20℃冷凍保存）.取3個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子送交華大基因測序.將測得的序列提交到NCBI GenBank比對，確定所得的序列為目標(biāo)基因序列.

1.4 土壤DNA的提取和TRGs的檢測

取0.5g保存的土樣提取土壤DNA，提取方法參照FastDNA?SPIN Kit for soil試劑盒，測定DNA濃度，-20℃保存.檢測土壤中的TRGs，檢測方法同1.3，以1.3中的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為陽性對照，無菌水為陰性對照.

1.5 TRGs的定量PCR（qPCR）分析

用E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit I（OMEGA，USA）試劑盒提取1.3中保存的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并測定質(zhì)粒的濃度以及純度，參考Zhang等［29］計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù).將質(zhì)粒進(jìn)行10倍的梯度稀釋，用來制作qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線.用SYBR?Premix Ex TaqTMKit （TaKaRa）進(jìn)行樣品分析，20μL反應(yīng)體系中含有10μL SYBR?Premix Ex TaqTM，0.5μM引物，1.0μL模版DNA（2～9ng DNA），以無菌水作為空白對照.每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增的條帶為目的條帶并且熔解曲線僅有1個(gè)峰.擴(kuò)增效率范圍為95.4%～102%，R2值為0.990～1.000.根據(jù)土壤的質(zhì)量和含水量計(jì)算TRGs的絕對數(shù)量（copy/g干土）.同時(shí)對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行定量，并計(jì)算TRGs與16S rRNA基因的比值（相對豐度），16S rRNA基因的定量方法參考Biddle等［30］.

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），圖由軟件Origin 8.6繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中TRGs的檢測

因?yàn)镠C處理施用的發(fā)酵豬糞量較高，推測該處理的土壤中可通過PCR方法檢測到的TRGs種類比LC處理多，因此本研究僅檢測了HC處理土壤中的TRGs.共檢測到9種TRGs（表1），其中4種為編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因（tetB（P）、tetO、tetS、tetW），4種為編碼外排泵的基因（tetG、tetL、tetZ、tetC），1種（tetX）為編碼鈍化酶的基因.9種TRGs中只有tetO完全是由發(fā)酵豬糞帶入土壤，在不施肥土壤中沒有檢測到該基因.

在發(fā)酵豬糞中有12種TRGs被檢測到，其中5種為編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因，7種為編碼外排泵的基因.在發(fā)酵豬糞中存在tetM、tetB、tetD 和tetY，并被帶到了土壤中，但是通過PCR方法并沒有在土壤中檢測到這4種TRGs，可能原因是經(jīng)過土壤的稀釋作用、攜帶抗性基因細(xì)菌的死亡或者稻麥輪作環(huán)境的影響之后，這4種TRGs消解、不存在或者少量存在于土壤中.在土壤中檢測到的9種基因中，除了tetZ，其他的8種基因均曾在養(yǎng)豬場附近的土壤中檢測到［26］，而且Zhu等［31］也在施用堆肥的田間土壤中檢測到了tetO、tetW、tetC、tetG和tetL，說明這些基因廣泛存在于受人類農(nóng)業(yè)活動影響的土壤中.

表1 發(fā)酵豬糞、施用9.0t/hm2發(fā)酵豬糞的土壤以及不施肥土壤中檢測到的TRGsTable 1 TRGs detected in the composted swine manure，the soil treated with 9.0t/hm2composted swine manure and soil without fertilizers

2.2 土壤中TRGs的絕對數(shù)量

經(jīng)過連續(xù)6年的施肥處理，土壤中tetZ、tetC 和tetS的絕對數(shù)量與不施肥的土壤相比無顯著差異，表明這3種基因的絕對數(shù)量沒有受到施肥的顯著影響.而tetG、tetL、tetB（P）、tetW和tetO的絕對數(shù)量顯著提高（圖1），其中tetW、tetO和tetB（P）均屬于編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因，tetL 和tetG屬于編碼外排泵的基因，說明發(fā)酵豬糞中攜帶的編碼核糖體保護(hù)蛋白和編碼外排泵的TRGs均能在施肥土壤中存留下來.在施肥土壤中tetG的數(shù)量最多，其次是tetL和tetB（P）. Zhu等［31］研究表明施用堆肥的土壤中tetG、tetL、tetA 和tetW的拷貝數(shù)最多，表明tetG和tetL在施用堆肥的土壤中大量存在.在不施肥的土壤中沒有檢測到tetO，而在施用發(fā)酵豬糞的土壤中tetO的數(shù)量超過了106copies/g.此外，0～5cm和5～10cm土層中的tetW、tetO、tetB（P）以及5～10cm土層的tetL受到了施肥用量的顯著影響，施肥量越高，這3種基因的絕對數(shù)量越高.而10～20cm土層中的tetW、tetO、tetB（P），0～5cm、10～20cm土層中的tetL，以及3個(gè)土層中的tetG絕對數(shù)量均不受施肥用量的影響；該結(jié)果表明在耕作層土壤中，上層土壤中的TRGs絕對數(shù)量受施肥用量的影響比下層土壤高，尤其是5～10cm土層最為明顯.

2.3 土壤中TRGs的相對豐度

為了降低土壤DNA提取效率和細(xì)菌數(shù)量背景值造成的影響，用TRGs的絕對數(shù)量與16S rRNA絕對數(shù)量的比值（即相對豐度）來分析攜帶TRGs的細(xì)菌在總細(xì)菌群落中所占的平均比例（圖2）.由表2可以看出:LC和HC處理的土壤中細(xì)菌16S rRNA的絕對數(shù)量顯著高于CK（大于10倍），說明發(fā)酵豬糞的施用顯著提高了土壤中細(xì)菌的數(shù)量；但是LC和HC處理土壤中tetZ、tetC 和tetS的絕對數(shù)量與CK無顯著差異（圖1）；因此在施肥土壤中，由于細(xì)菌群落數(shù)量擴(kuò)大所造成的稀釋作用，使得攜帶tetZ、tetC和tetS的相對豐度顯著低于不施肥土壤.

在10～20cm土層中，tetW的數(shù)量變化與以上3種TRGs一樣，而在0～5cm和5～10cm土層中，HC處理中tetW的絕對數(shù)量顯著高于CK，而tetW的相對豐度與CK無顯著差異，說明連續(xù)施用發(fā)酵豬糞之后，0～5cm和5～10cm土層中的tetW絕對數(shù)量增加的幅度與細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)量增加的幅度一致，這種增加可能是由于發(fā)酵豬糞提供的養(yǎng)分使土著抗性細(xì)菌繁殖引起，也有可能是發(fā)酵豬糞中攜帶的抗性細(xì)菌及抗性基因在土壤中的存活和繁殖引起，或者兩者的共同作用引起.

與CK相比，HC和LC處理中tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數(shù)量和相對豐度均顯著增加，說明施用發(fā)酵豬糞顯著提高了細(xì)菌種群中攜帶該類TRGs的平均數(shù)量.除tetO （0～5cm和5～10cm）的相對豐度受到了施肥量的影響外，其余7個(gè)基因以及10～20cm土層中的tetO的相對豐度均不受施肥重量的影響，可能是由于本研究設(shè)置的施肥量不足以引起土壤中的這7種TRGs產(chǎn)生顯著變化；或者是由于LC處理設(shè)置的施肥量已經(jīng)使土壤中的這7種TRGs數(shù)量達(dá)到了最高閾值或平衡.Fahrenfeld等［32］提出土壤ARG的積累公式:ARG累積=ARG加入+ARG增加-ARG衰退±ARG徑流-ARG滲透（其中ARG增加是指由于宿主的繁殖增長、抗生素的選擇作用或ARG水平轉(zhuǎn)移引起的ARG增加），可能是由于該公式中的一個(gè)或多個(gè)因素影響了土壤中TRGs的數(shù)量，使得施用不同用量發(fā)酵豬糞的土壤中，除tetO外的7個(gè)TRGs均無顯著差異. tetO一般位于革蘭氏陽性細(xì)菌的質(zhì)粒上，且多存在于好氧細(xì)菌中［33］，對豬糞進(jìn)行好氧發(fā)酵處理可能有利于tetO的殘留.

圖1 施用發(fā)酵豬糞6年的土壤中8種TRGs的絕對數(shù)量Fig.1 The absolute abundance of the 8 TRGs in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure and the soil without fertilizers

表2 土壤和發(fā)酵豬糞中16S rRNA的絕對數(shù)量Table 2 The abundance of bacteria in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure， the soil without fertilizers and the composted swine manure

圖2 施用發(fā)酵豬糞6年后土壤中TRG的相對豐度Fig.2 The relative abundance of 8 TRGs in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure as compared with the soil without fertilizers

在耕作層的3個(gè)土壤深度之間，同處理中的各TRGs相對豐度并無顯著差異，可能是因?yàn)楸狙芯坎杉氖堑炯灸┩寥溃谒痉N植期淹水過程中，由于水分和養(yǎng)分的滲透擴(kuò)散作用使攜帶同種TRGs的細(xì)菌在各處理耕作層土壤中均勻分布.

2.3 施用發(fā)酵豬糞對土壤TRGs的影響

發(fā)酵豬糞中的TRGs數(shù)量見表3，在分析的8 種TRGs中，tetG是土壤中數(shù)量最多的基因，而在發(fā)酵豬糞中數(shù)量最多的基因是tetL，其次是tetG 和tetZ，這3種基因的數(shù)量均超過了109copies/g（相對豐度＞1%）.表明本研究小型有機(jī)肥廠生產(chǎn)的供試發(fā)酵豬糞中殘留了多種TRGs，而這些殘留的TRGs影響了土壤中TRGs的組成和豐度.由于本研究只取了施肥6年中最近一次所施用的發(fā)酵豬糞進(jìn)行分析，可能以前所施用的發(fā)酵豬糞中攜帶的TRGs種類或者數(shù)量與本次有所不同；但是，從圖1和圖2的結(jié)果可以看出，連續(xù)施用該發(fā)酵豬糞對土壤TRGs造成了顯著影響.因此，對于此類有機(jī)肥廠，仍需要改變發(fā)酵方法或優(yōu)化發(fā)酵工藝來降低其中攜帶的抗性基因以削減可能造成的污染風(fēng)險(xiǎn).

表3 發(fā)酵豬糞中TRGs的絕對數(shù)量和相對豐度Table 3 Relative abundance and absolute abundance of TRGs in the composted swine manure

糞肥主要通過以下3種方式影響土壤中的抗性基因:糞肥中殘留的抗生素對土著抗性細(xì)菌的選擇誘導(dǎo)作用，糞肥中抗性細(xì)菌的殘存和滲入，以及可在細(xì)菌群落中水平轉(zhuǎn)移的ARGs移動元件的匯集.已有研究表明向土壤中添加含有抗生素的水或者含有抗生素的稀釋有機(jī)質(zhì)并不能誘導(dǎo)土壤抗性細(xì)菌的增加，而且?guī)缀醪粫淖兾⑸锶郝涞慕M成［2］.因此推測發(fā)酵豬糞中殘留的抗生素不足以引起TRGs的顯著增加，發(fā)酵豬糞中的養(yǎng)分及其攜帶的抗性細(xì)菌和抗性基因可能是引起土壤TRGs數(shù)量增加的主要因素.

Ghosh等［34］發(fā)現(xiàn)以農(nóng)學(xué)上可接受的頻率向農(nóng)田施用經(jīng)過處理的動物糞肥，不會引起土壤中抗性細(xì)菌的大量增加，而直接施用大量新鮮糞肥卻可以.雖然施用含有高水平抗性細(xì)菌的糞肥會短期內(nèi)增加土壤微生物的抗性水平，但是在糞肥施用的6個(gè)月之內(nèi)，土壤細(xì)菌的抗性水平會回到施肥前的水平［11］，說明糞肥驅(qū)動的抗性細(xì)菌可以在土壤中存活有限的一段時(shí)間，但是在這期間，土壤中的ARGs可能會水平轉(zhuǎn)移到土壤土著細(xì)菌中［34］.Schmitt等［13］檢測了豬糞和施用豬糞前后的土壤中的四環(huán)素類抗性基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施用糞肥后的土壤中含有的一部分抗性基因是原來土壤所沒有的，是豬糞中特有的，證明這部分抗性基因是由于施用豬糞而帶入的.由于研究方法的不同，糞肥施用對土壤可培養(yǎng)抗性細(xì)菌數(shù)量的影響與其對土壤抗性基因的影響并不是一致的.

本研究表明，在稻麥輪作模式下，連續(xù)施用含有殘留TRGs的豬糞發(fā)酵有機(jī)肥會使土壤中某些TRGs的數(shù)量增加.由于抗性基因種類繁多，難以在研究中將所有已知種類的抗性基因全部包括，而且不同的抗性基因之間或許存在互補(bǔ)作用，某一類基因相對豐度的降低也可能伴隨著另外一種基因相對豐度的增加同時(shí)發(fā)生；此外，不同的抗性基因有著不同的結(jié)局，例如本研究中的tetZ 和tetO所呈現(xiàn)的研究結(jié)果完全不同，這可能不僅僅取決于抗生素的選擇作用，更取決于土壤中宿主細(xì)菌數(shù)量的消長以及基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的趨勢.因此，創(chuàng)新研究ARGs的方法，深入了解不同ARG在環(huán)境中的特性及其污染風(fēng)險(xiǎn)，才能更好的指導(dǎo)農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)生產(chǎn)活動，減少人類活動對環(huán)境ARGs的影響.

3 結(jié)論

3.1 本研究通過qPCR方法分析了連續(xù)施用攜帶TRGs的發(fā)酵豬糞對土壤TRGs數(shù)量的影響，在所分析的8種TRGs中，tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數(shù)量和相對豐度均明顯增加，而tetZ、tetC、tetS和tetW受到的影響相對較小.

3.2 tetO是分析的8種TRGs中受施肥用量影響較大的基因，其在0～5cm及5～10cm土層土壤中的數(shù)量與施肥的用量顯著正相關(guān).

3.3 連續(xù)施用攜帶高量TRGs殘留的發(fā)酵豬糞會顯著增加土壤中TRGs的數(shù)量，發(fā)酵不徹底的豬糞與新鮮豬糞一樣具有污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn).

［1］徐冰潔，羅 義，周啟星，等.抗生素抗性基因在環(huán)境中的來源、傳播擴(kuò)散及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn) ［J］. 環(huán)境化學(xué)， 2010，29（2）:169-178

［2］Negreanu Y， Pasternak Z， Jurkevitch E， et al. Impact of treated wastewater irrigation on antibiotic resistance in agricultural soils ［J］. Environ. Sci. Technol.， 2012，46（9）:4800-4808.

［3］Chee-Sanford J C， Mackie R I， Koike S， et al. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste ［J］. J. Environ. Qual.， 2009，38（3）:1086-1108.

［4］Alvarez J A， Otero L， Lema J M， et al. The effect and fate of antibiotics during the anaerobic digestion of pig manure ［J］. Bioresour. Technol.， 2010，101（22）:8581-8586.

［5］Resende J A， Silva V L， de Oliveira T L， et al. Prevalence and persistence of potentially pathogenic and antibiotic resistant bacteria during anaerobic digestion treatment of cattle manure ［J］. Bioresour. Technol.， 2014，153:284-291.

［6］Hsu J T， Chen C Y， Young C W， et al. Prevalence of sulfonamide-resistant bacteria， resistance genes and integronassociated horizontal gene transfer in natural water bodies and soils adjacent to a swine feedlot in northern Taiwan ［J］. J. Hazard Mater， 2014，277:34-43.

［7］Pakpour S， Jabaji S， Chenier M R. Frequency of antibiotic resistance in a swine facility 2.5 years after a ban on antibiotics ［J］. Microb. Ecol.， 2012，63（1）:41-50.

［8］Ji X， Shen Q， Liu F， et al. Antibiotic resistance gene abundances associated with antibiotics and heavy metals in animal manures and agricultural soils adjacent to feedlots in Shanghai； China ［J］. J. Hazard Mater， 2012，235-236:178-185.

［9］Zhang F， Li Y， Yang M， et al. Content of heavy metals in animalfeeds and manures from farms of different scales in northeast China ［J］. Int. J. Environ. Res. Public Health， 2012，9（8）:2658-2668.

［10］Forsberg K J， Reyes A， Wang B， et al. The shared antibiotic resistome of soil bacteria and human pathogens ［J］. Science，2012，337（6098）:1107-1111.

［11］Sengel?v G， Agers? Y， Halling-S?rensen B， et al. Bacterial antibiotic resistance levels in Danish farmland as a result of treatment with pig manure slurry ［J］. Environ. Int.， 2003，28（7）: 587-595.

［12］Byrne-Bailey K G， Gaze W H， Kay P， et al. Prevalence of sulfonamide resistance genes in bacterial isolates from manured agricultural soils and pig slurry in the United Kingdom ［J］. Antimicrob. Agents Chemother.， 2009，53（2）:696-702.

［13］Schmitt H， Stoob K， Hamscher G， et al. Tetracyclines and tetracycline resistance in agricultural soils: microcosm and field studies ［J］. Microb. Ecol.， 2006，51（3）:267-276.

［14］Dolliver H， Gupta S， Noll S. Antibiotic degradation during manure composting ［J］. J Environ. Qual.， 2008，37（3）:1245-1253.

［15］Wu X， Wei Y， Zheng J， et al. The behavior of tetracyclines and their degradation products during swine manure composting ［J］. Bioresour. Technol.， 2011，102（10）:5924-5931.

［16］Selvam A， Zhao Z， Li Y， et al. Degradation of tetracycline and sulfadiazine during continuous thermophilic composting of pig manure and sawdust ［J］. Environmental Technology， 2013，34（16）: 2433-2441.

［17］Hu Z， Liu Y， Chen G， et al. Characterization of organic matter degradation during composting of manure-straw mixtures spiked with tetracyclines ［J］. Bioresour. Technol.， 2011，102（15）:7329-7334.

［18］Wu X， Wei Y， Zheng J， et al. The behavior of tetracyclines and their degradation products during swine manure composting ［J］. Bioresour. Technol.， 2011，102（10）:5924-5931.

［19］Selvam A， Zhao Z， Wong J W. Composting of swine manure spiked with sulfadiazine， chlortetracycline and ciprofloxacin ［J］. Bioresour. Technol.， 2012，126:412-417.

［20］Selvam A， Xu D， Zhao Z， et al. Fate of tetracycline， sulfonamide and fluoroquinolone resistance genes and the changes in bacterial diversity during composting of swine manure ［J］. Bioresour. Technol.， 2012，126:383-390.

［21］Yu Z， Michel F C， Hansen G， et al. Development and application of real-time PCR assays for quantification of genes encoding tetracycline resistance ［J］. Appl. Environ. Microbiol.， 2005，71（11）: 6926-6933.

［22］Thaker M， Spanogiannopoulos P， Wright G D. The tetracycline resistome ［J］. Cell Mol. Life Sci.， 2010，67（3）:419-431.

［23］Zhang X X， Zhang T， Fang H H P. Antibiotic resistance genes in water environment ［J］. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2009，82（3）: 397-414.

［24］Aminov R I， Garrigues-Jeanjean N， Mackie R I. Molecular ecology of tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins ［J］. Appl. Environ. Microbiol.， 2001，67（1）:22-32.

［25］Aminov R I， Chee-Sanford J C， Garrigues N， et al. Development，validation， and application of PCR primers for detection of tetracycline efflux genes of gram-negative bacteria ［J］. Appl. Environ. Microbiol.， 2002，68（4）:1786-1793.

［26］Ng L K， Martin I， Alfa M， et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes ［J］. Molecular and Cellular Probes，2001，15:209-215.

［27］Perreten V， Vorlet-Fawer L， Slickers P， et al. Microarray-based detection of 90 antibiotic resistance genes of gram-positive bacteria ［J］. J. Clin. Microbiol.， 2005，43（5）:2291-2302.

［28］You Y， Hilpert M， Ward M J. Detection of a common and persistent tet（L）-carrying plasmid in chicken-waste-impacted farm soil ［J］. Appl. Environ. Microbiol.， 2012，78（9）:3203-3213.

［29］Zhang T， Zhang M， Zhang X， et al. Tetracycline resistance genes and tetracycline resistant lactose-fermenting Enterobacteriaceae in activated sludge of sewage treatment plants ［J］. Environ. Sci. Technol.， 2009.43（10）:3455-3460.

［30］Biddle J F， Fitz-Gibbon S， Schuster S C， et al. Metagenomic signatures of the Peru Margin subseafloor biosphere show a genetically distinct environment ［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，2008，105（30）:10583-10588.

［31］Zhu Y G， Johnson T A， Su J Q， et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms ［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A， 2013，110（9）:3435-3440.

［32］Fahrenfeld N， Knowlton K， Krometis L A， et al. Effect of manure application on abundance of antibiotic resistance genes and their attenuation rates in soil: field-scale mass balance approach ［J］. Environ. Sci. Technol.， 2014，48（5）:2643-2650.

［33］Chopra I， Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action，applications， molecular biology， and epidemiology of bacterial resistance ［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65（2）:232-260.

［34］Ghosh S， LaPara T M. The effects of subtherapeutic antibiotic use in farm animals on the proliferation and persistence of antibiotic resistance among soil bacteria ［J］. ISME J.， 2007，1（3）:191-203.

Abundance of the tetracycline resistance genes in a paddy soil after continuous application of composted swine manure for 6 years.

PENG Shuang1，2，3， WANG Yi-ming1，2， LIN Xian-gui1，2*（1.State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008， China；2.Joint Open Laboratory of Soil and the Environment， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences and Hong Kong Baptist University， Nanjing 210008， China）. China Environmental Science， 2015，35（4）：1173～1180

In the present study， the occurrence and abundance of tetracycline resistance genes （TRGs） were investigated in a paddy soil after continuous application of composted swine manure （9.0t/hm2and 4.5t/hm2） for 6years. Nine classes of TRGs （tetW， tetB（P）， tetO， tetS， tetC， tetG， tetZ， tetL， and tetX） was detected in the soil applied with composted swine manure， among which the absolute abundance of tetG， tetL， tetB（P）， tetO， tetW were significantly increased， and there were significantly more copies of tetB（P）， tetW， tetO in the soil treated with 9.0t/hm2composted swine manure than with 4.5t/hm2， while the absolute abundance of tetZ， tetC and tetS was not influenced. There was no significant difference in the relative abundance of detected TRGs distributed with a depth of 0～5cm， 5～10cm， and 10～20cm in the same treatment. The relative abundance of tetG， tetL， tetB（P） and tetO was significantly increased in the soils treated with composted swine manure， but only tetO was influenced by the application weight of the manure. The results suggested that the residual TRGs in the composted swine manure shed further influence on the TRGs pool in soils with rice-wheat crop rotation， absolute and relative abundance of tetG， tetL， tetB（P） and tetO being significantly increased after continuous application of composted swine manure. Therefore， optimization of composting strategies is urgently needed to efficiently reduce the content of antibiotic resistance genes in the composted swine manure.

tetracycline resistance genes；manure；gene contamination；antibiotic resistance

X53，R944.6

A

1000-6923（2015）04-1173-08

彭 雙（1986-），女，河南信陽人，博士后，主要從事土壤微生物研究.發(fā)表論文5篇.

2014-08-12

國家自然科學(xué)基金（21377137，20607024）；中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDA05020800）；國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD05B04）

* 責(zé)任作者， 研究員， xglin@issas.ac.cn