解世朋 王 浩 常永業(yè) 石慧君 張銘連

三個原發(fā)位點突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變中醫(yī)證候及臨床特點分析

解世朋 王 浩 常永業(yè) 石慧君 張銘連

目的探討臨床最常見的3個原發(fā)致病基因突變導致的Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者的中醫(yī)證候特點和辨證規(guī)律。方法回顧分析2001年12月至2013年12月在河北省眼科醫(yī)院（原邢臺市眼科醫(yī)院）就診具有ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A線粒體DNA突變陽性的219例Leber遺傳性視神經(jīng)病變先患者的中醫(yī)證候特點和辨證分型，分析各證型與3個原發(fā)基因突變的關(guān)系，總結(jié)Leber遺傳性視神經(jīng)病變的中醫(yī)證候特點和辨證規(guī)律。結(jié)果219例患者中ND4 G11778A突變188例，ND6 T14484C突變23例，ND1 G3460A突變8例。中醫(yī)辨證為肝經(jīng)郁熱107例，其中ND4 G11778A突變92例，ND6 T14484C突變10例，ND1 G3460A突變5例；肝郁陰虛45例，其中ND4 G11778A突變38例，ND6 T14484C突變6例，ND1 G3460A突變1例；肝腎陰虛67例，其中ND4 G11778A突變58例，ND6 T14484C突變7例，ND1 G3460A突變2例。結(jié)論具有3個原發(fā)基因突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者發(fā)病與肝腎聯(lián)系最為密切，早期以實證為主，多表現(xiàn)為肝經(jīng)郁熱；中期虛實夾雜，多表現(xiàn)為肝郁陰虛；晚期以虛證為主，多表現(xiàn)為肝腎陰虛。

Leber遺傳性視神經(jīng)病變；中醫(yī)證候；線粒體；基因突變

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber′s hereditary optic neuropathy，LHON）是眼科常見的一種線粒體DNA突變導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性病變的母系遺傳性疾病。1871年，德國眼科醫(yī)生Leber首先報道了該病的臨床特征〔1〕，1988年Wallace等〔2〕首次發(fā)現(xiàn)該病與線粒體DNA（mitochondrial，mtDNA）MT-ND4基因的11778G＞A突變有關(guān)，到目前為止，已經(jīng)報道的與LHON發(fā)病有關(guān)的mtDNA有60多個［http：//www. mitomap.org］，而90%～95%的患者只攜帶該病3個mtDNA原發(fā)突變（即3460G＞A、11778G＞A或14484T＞C）中的一個。近年來，本病分子遺傳學方面的研究取得較大進展，但在治療方法及藥物方面并沒有大的突破，因此，探討分析LHON患者的中醫(yī)證候特點，總結(jié)其辨證規(guī)律，對指導中醫(yī)藥干預治療有一定的臨床意義。我們回顧性研究了在河北省眼科醫(yī)院（原邢臺市眼科醫(yī)院）就診具有ND4G11778A、ND6T14484C、ND1 G3460A線粒體DNA突變陽性的Leber遺傳性視神經(jīng)病變先證者，總結(jié)了其中醫(yī)證候特點及辨證分型規(guī)律。

1 資料和方法

1.1 病例資料及入選標準

對2001年12月至2013年12月就診于邢臺市眼科醫(yī)院符合以下入選標準的LHON患者進行研究。病例入選標準：①mtDNA檢測ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A至少一個位點突變陽性；②進行視野、視覺電生理、FFA等檢查排除合并Best病、stargardt病、青光眼等引起視功能受損的其它眼病；③行頭顱CT或MRI排除顱內(nèi)疾患。

1.2 研究方法

對符合病例入選標準具有ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A位點突變的LHON患者進行病歷回顧，總結(jié)分析其病史、中醫(yī)問診、望診和切診情況、辨證分型、視力、眼底、視覺電生理、熒光素眼底血管造影、自動靜態(tài)視野等檢查結(jié)果，總結(jié)其中醫(yī)辨證分型、發(fā)病誘因、伴隨癥狀及臨床特點。

1.3 基因檢測方法

所有病例均委托浙江大學進行mtDNA檢測。抽取患者外周靜脈血2 ml，采用濾紙片法郵寄至浙江大學生命科學院。取1 cm2的濾紙片放到1.5 ml的離心管中，加入滅菌的DNA提取緩沖液500 μl至離心管中，然后再加入30 μl新鮮配制的蛋白酶K溶液，混勻，置于37℃水浴箱過夜。放入乙二胺四乙酸抗凝管中，采用酚-氯仿抽提法提取外周血白細胞DNA。應用Primer 3軟件設(shè)計mtDNA目的片段引物，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增片段。引物序列為17F（5'-TCACTCTCACTGCCCAAGAA-3'）、17R（5'-GGAGAATGGGGGATAGGTGT-3'）、21F（5'-GCATAATTAAACTTTACTTC-3'）。PCR反應體系為50 μl： 25 μl Taq Mix，上下游物各1 μl、基因組DNA80 ng，加去離子水至50 μl。PCR反應條件：95℃預變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復循環(huán)36次，最后72℃延伸10 min。采用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物是否為單一目的條帶，切膠回收，過柱純化后由上海快基生物科技有限公司進行測序反應并進行測序結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 基因分布與發(fā)病年齡

219例入選患者中，ND4 G11778A突變188例，男性124例，女性64例，年齡最小6歲，最大45歲，平均（18.32±6.25）歲；ND6 T14484C突變23例，男性16例，女性7例，年齡最小7歲，最大36歲，平均（16.32±4.25）歲，ND1 G3460A突變8例，男性6例，女性2例，年齡最小7歲，最大26歲，平均（16.13± 6.4）歲。發(fā)病至就診時間最短為2天，最長為183天，平均（20.27±23.71）天。

2.2 中醫(yī)證候結(jié)果

（1）肝經(jīng)郁熱證107例，其中ND4 G11778A突變92例，ND6 T14484C突變10例，ND1 G3460A突變5例，該型證候特點為發(fā)病1～2個月，發(fā)病前有緊張、勞累、劇烈運動等誘因或無誘因，眼部表現(xiàn)為患眼視物模糊，視盤色紅，鼻側(cè)較重，盤周視網(wǎng)膜血管擴張，中心凹光反射不見，伴情志抑郁、胸悶易怒，舌質(zhì)紅，苔薄白，脈弦細。（2）肝郁陰虛45例，其中ND4 G11778A突變38例，ND6 T14484C突變6例，ND1 G3460A突變1例，證候特點為發(fā)病時間超過3個月，眼部表現(xiàn)為患眼視物模糊，視盤鼻側(cè)色紅，顳側(cè)色淡，乳斑間神經(jīng)纖維變薄，色澤發(fā)暗，視網(wǎng)膜血管走形大致正常，中心凹光反射不見，舌質(zhì)紅，苔薄白，脈弦細，或伴腰膝酸軟，精神抑郁等。（3）肝腎陰虛67例，其中ND4G11778A突變58例，ND6T14484C突變7例，ND1 G3460A突變2例，證候特點為發(fā)病時間超過6個月，眼部表現(xiàn)為患眼視物模糊，視盤淡或色蒼白，乳斑間神經(jīng)纖維變薄，色澤發(fā)暗，視網(wǎng)膜動脈變細，中心凹光反射不見，舌質(zhì)紅，苔少，脈細數(shù)，或伴五心煩熱、潮熱盜汗、遺精等。

2.3 致病誘因及職業(yè)分析

頭面部外傷3例；感冒或其他原因發(fā)熱11例；劇烈運動4例；學習緊張13例；勞累（農(nóng)忙、軍事訓練等）8例；口服抗結(jié)核藥物治療1例，無明顯誘因179例；職業(yè)分布：學齡前兒童11例，小學生73例，初中生44例，高中生15例，大學生9例，農(nóng)民39例，工人12例，司機6例，軍人4人，公務(wù)員6人。

2.4 中醫(yī)證候、基因位點、性別與平均視力（logMAR）關(guān)系

肝郁陰虛型G11778A男性患者logMAR視力最差（一般線性模型方差分析，F(xiàn)=4.15，P=0.017）；6個月后各組患者平均視力均優(yōu)于發(fā)病時視力（配對t檢驗，t=94.59，P=0.001），其中G11778A男性患者平均視力最差（一般線性模型方差分析，F(xiàn)=6.624，P= 0.011，表1）。

3 討論

Leber遺傳性視神經(jīng)病變近年報道了很多與之發(fā)病相關(guān)的位點，但是臨床上最多見的仍然是ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A三個原發(fā)突變位點。雖然LHON為母系遺傳性疾病，但是表現(xiàn)為不完全外顯，存在明顯的性別差異，不同位點突變的患者，甚至是同一家族中不同的患者最終視功能存在很大差異。LHON發(fā)病為線粒體DNA突變所致，而線粒體為細胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，為細胞活動提供能量，有“細胞動力工廠”之稱，我們在調(diào)查患者的發(fā)病誘因時發(fā)現(xiàn)部分患者在出現(xiàn)頭面部外傷、發(fā)熱、劇烈運動或精神緊張、勞累等人體應激反應后發(fā)病，考慮可能在這種條件下細胞的能量消耗增加，刺激線粒體合成更多的ATP，加重線粒體負荷，使本身存在缺陷的細胞不堪重負，而出現(xiàn)功能障礙，從而導致視功能受損。有報道LHON有自我恢復現(xiàn)象，11778，3460，14484不同突變位點患者，最終視力自行恢復率分別是4%，22%及37%〔3，4〕，但是目前現(xiàn)代醫(yī)學對LHON的治療策略仍然有限，大多認為短鏈醌類化合物（如艾地苯醌），在疾病的早期階段對LHON患者的視力有保護作用，另外基因治療雖然是一種很好的方法，但是仍然處于試驗階段〔5，6〕。中醫(yī)也對LHON做了較多的研究，周劍認為LHON的發(fā)病與中醫(yī)體質(zhì)有密切的聯(lián)系〔7〕，而孫艷紅的研究結(jié)果證明LHON組及發(fā)病組中平和質(zhì)的比例均降低，陰虛質(zhì)和氣郁質(zhì)比例均增高〔8，9〕，張銘連〔10，11〕曾先后對66例及81例LHON患者進行中醫(yī)辨證及治療，認為LHON患者發(fā)病與中醫(yī)肝腎關(guān)系最為密切，早期多表現(xiàn)為肝經(jīng)郁熱、晚期多表現(xiàn)為肝郁陰虛或肝腎陰虛型，應用中醫(yī)辨證治療后部分患者的視力得到提高。本研究旨在發(fā)現(xiàn)不同的中醫(yī)證候與LHON發(fā)病之間的聯(lián)系，從而指導中醫(yī)辨證治療。本組研究發(fā)現(xiàn)Leber發(fā)病，早期多以實證為主，表現(xiàn)為肝經(jīng)郁熱，眼底表現(xiàn)為視盤色紅，鼻側(cè)較重，盤周視網(wǎng)膜血管擴張，中心凹光反射不見，全身伴情志抑郁、胸悶易怒等；中期發(fā)展為虛實夾雜，表現(xiàn)為肝郁陰虛，眼底表現(xiàn)為視盤鼻側(cè)色紅，顳側(cè)色淡，乳斑間神經(jīng)纖維變薄，色澤發(fā)暗，中心凹光反射不見，全身伴腰膝酸軟，精神抑郁等；晚期多以虛證為主，表現(xiàn)為肝腎陰虛，眼底表現(xiàn)為視盤淡或色蒼白，乳斑間神經(jīng)纖維變薄，色澤發(fā)暗，視網(wǎng)膜動脈變細，中心凹光反射不見，舌質(zhì)紅，苔少，脈細數(shù)，全身伴五心煩熱、潮熱盜汗、遺精等。

表1 Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因位點、性別、中醫(yī)證候與平均視力的關(guān)系

Leber遺傳性視神經(jīng)病變屬于中醫(yī)眼科“青盲”的范疇。中醫(yī)證候上LHON與肝腎關(guān)系最為密切。中醫(yī)認為肝開竅于目，經(jīng)脈上連目系，“肝受血而能視”，“肝和則目能辨五色矣”?！澳I為先天之本”，腎主藏精，精能生髓，腦為髓海，目系內(nèi)通于腦。肝腎同源，精血相互化生。因此，肝腎與目系的關(guān)系最為密切，正如張景岳所說“肝腎之氣充則神采光明”。本組研究中發(fā)現(xiàn)在三個原發(fā)位點突變的LHON患者中，肝郁陰虛型視力最差，而肝腎陰虛型視力反而較好，考慮與LHON的發(fā)病特點及采用的中醫(yī)辨證方法有關(guān)，由于本病有一定的自行恢復特點，而我們辨證采用的是辨病、辨證相結(jié)合的方法，肝經(jīng)郁熱及肝郁陰虛型患者正值疾病的進展期，而有些晚期LHON患者，眼底視盤顏色蒼白，表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮，見舌質(zhì)紅、脈細，辨證為肝腎陰虛，而這些患者可能已經(jīng)經(jīng)歷了視功能的自我恢復過程，因而視功能反而好于肝經(jīng)郁熱及肝郁陰虛型。以上研究結(jié)果提示我們，LHON發(fā)病與肝腎關(guān)系最為密切，在治療上應注重解肝郁，養(yǎng)肝血，滋腎陰，尤其在本病的中期，表現(xiàn)為肝郁陰虛，視功能受損嚴重，治療上應傾向于疏肝解郁，滋陰明目為主。

［1］Leber T.Ueber hereditaere und congenital angelegte sehnervenleiden［J］.Graefes Arch Ophthal，1871，17（2）：249-291.

［2］Wallace DC SG，Lott MT，Hodge JA，et al.Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy［J］.Science，1988，242（4884）：1427-1430.

［3］Johns DR，Heher KL，Miller NR，et al.Leber's hereditary optic nerropathy：clinical manifestations of the 14484 mutation［J］.Arch Ophthalmol，1993，111（4）：195-198.

［4］Miller NR，Newman NJ.Walsh&hoyt's clinical neuro-phalmology［M］.5thed，Baltimore：Williams&Wilkins，1999：304.

［5］Gueven N，F(xiàn)aldu D.Therapeutic strategies for Leber's hereditary optic neuropathy：A current update［J］.Intractable Rare Dis Res，2013，2（4）：130-135.

［6］La Morgia，Carbonelli，Barboni.Medical management of hereditary optic neuropathies［J］.Front Neurol，2014，31（5）：141.

［7］周劍，孫艷紅，韋企平.Leber遺傳性視神經(jīng)病變的中醫(yī)體質(zhì)學思考［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2010，20（4）：232-234.

［8］孫艷紅，韋企平，周劍，等．Leber遺傳性視神經(jīng)病變14484位點突變的中醫(yī)體質(zhì)學研究［J］．中國中醫(yī)眼科雜志，2009，19（5）：270-273．

［9］孫艷紅，韋企平，周劍，等.Leber遺傳性視神經(jīng)病變的中醫(yī)體質(zhì)學研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36（5）：349-352.

［10］張銘連，石慧君，常永業(yè).Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA檢測及中醫(yī)治療分析［J］.河北中醫(yī)，2007，29（1）：51-53.

［11］張銘連，石慧君，龐朝善.Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA檢測及中醫(yī)辨證分析［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2006，16（1）：9-11.

Analysis of clinical characteristics and TCM syndrome on three primary mutations of Leber hereditary optic neuropathy

XIE Shiming，WANG Hao，CHANG Yongye，et al.Hebei Eye Hospital，Hebei Institute of Ophthalmology of TCM，Xingtai 054001，China

OBJECTIVE To investigate the three primary pathogenic mutations in Leber hereditary optic neuropathy caused by dialectical law of medicine.METHODS Retrospectively analysed the characteristics of TCM differentiation of syndromes，the relationship between the syndromes and three primary mutations links，and summarized Leber's hereditary optic neuropathy TCM law for 219 patients with ND4 G11778A，ND6 T14484C，ND1 G3460A mitochondrial DNA mutation-positive cases of Leber's hereditary optic neuropathy symptoms from December 2001 to December 2013 in Hebei Provincial Eye Hospital（former Xingtai City Eye Hospital）.RESULTS Among 219 cases，ND4 G11778A mutation was in 188 cases，ND6 T14484C mutation in 23 cases，ND1 G3460A mutation in 8 cases.Among TCM Ganjing Yure107cases，ND4 G11778A mutation was in 93 cases，ND6 T14484C mutations in 9 cases，ND1 G3460A mutation in 5 cases；Ganyu Yinxu 45 cases，ND4 G11778A mutation was in 38 cases，ND6 T14484C mutations in 6 cases，ND1 G3460A mutation in 1 case；TCM for Ganshen Yinxu 67 cases，58 cases was in the ND4 G11778A mutation，ND6 T14484C mutations in 7 cases，ND1 G3460A mutation in 2 cases. CONCLUSIONS With three primary mutations in patients with Leber's hereditary optic neuropathy TCM most closely connected with the liver and kidney，early stage showed excess syndrome，mid-term was mixed，and late stage was deficiency syndrome.

Leber hereditary optic neuropathy；TCM syndrome；mitochondria；gene mutation

R774.6

A

1002-4379（2015）05-0331-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.006

國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目經(jīng)費資助（編號zk0301yk005）河北省科技支撐計劃（編號：11276103D-12）

河北省眼科醫(yī)院，河北省中醫(yī)眼科研究所，河北省眼科學重點實驗室，邢臺054001

張銘連，E-mail：zhmlyk@sohu.com