張凱麗，翁瑞旋，李 雙，王 赟，張桂花，李玉鵬*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

云南球花石斛提取物體外自由基清除活性研究

張凱麗1，2，翁瑞旋1，李 雙1，王 赟1，張桂花1，李玉鵬1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

采用DPPH自由基清除法對云南球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum） 95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇5種提取物的體外自由基的清除作用進(jìn)行研究。試驗結(jié)果表明，球花石斛乙酸乙酯粗提物的自由基清除效果最顯著，其IC50為0.11 mg/mL。球花石斛提取物在抗氧化方面有一定的應(yīng)用價值，該研究工作對球花石斛的開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

球花石斛；藥用植物；自由基清除活性

石斛是常用名貴中藥材，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）多種植物的新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱。在中國76種石斛屬植物中有30多種作藥用。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，石斛被列為上品，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、明目強身等功效［1］。球花石斛［2］（Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f）為蘭科石斛屬（Dendrobium Sw）多年生草本植物，附生于海拔1 100～1 800 m的山地林中樹干上。分布于云南南部至西南部，印度東北部、緬甸、泰國、老撾、越南亦產(chǎn)。為滿足石斛商品市場的需要，于1998年被收入江蘇省藥材標(biāo)準(zhǔn)。從球花石斛分得聯(lián)芐、菲類、芴酮、香豆素和多糖等類型的化學(xué)成分［3～11］。為了開發(fā)和應(yīng)用該藥用植物，尋找到該植物藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，在對云南產(chǎn)束花石斛體外抗氧化活性研究的基礎(chǔ)上［12］，筆者對云南產(chǎn)球花石斛體外自由基清除活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：722 s型可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化），F(xiàn)A 2004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。試劑：DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，Sigma-Fluka公司產(chǎn)品）；蘆丁對照品（中國醫(yī)藥集團(tuán)貴州生物試劑公司）；95%乙醇（分析純，天津化學(xué)試劑有限公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 植物來源

球花石斛于2013年5月15日采自云南思茅，標(biāo)本保存于昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室。

1.3 提取與分離

球花石斛0.30 kg，用95%乙醇提取5次，減壓回收至無乙醇味，得乙醇提取物41.0 g。乙醇提取物用水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇進(jìn)行萃取，減壓濃縮后分別得到石油醚5.0 g、乙酸乙酯5.5 g、正丁醇9.5 g、甲醇13.0 g 5個部分，乙醇提取物和萃取的各部分分別取20 mg進(jìn)行體外自由基清除活性測試。

1.4 自由基清除活性測定

1.4.1 DPPH液的配制

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑25 mg，用95%分析純的乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為100 mg/L的DPPH儲備液，置于冰箱中冷藏備用。

1.4.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取待測試樣品20 mg，溶解在分析純的乙醇中，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為200 mg/L的樣品溶液，置于冰箱中冷藏備用。

1.4.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁2.5 mg，溶解在分析純的乙醇中，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為25 mg/L的樣品溶液，置于冰箱中冷藏。

1.4.4 清除DPPH自由基能力的測定

準(zhǔn)確量取1.2 mL DPPH液，加入2.8 mL 95%乙醇溶液，混勻，在λ=520 nm測吸光度作為Ac值，自由基清除率為零。分別準(zhǔn)確量取各樣品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入1.2 mL DPPH液及2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL的95%乙醇溶液混合均勻，在λ=520 nm測吸光度作為Ai值。另外分別準(zhǔn)確量取各樣品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入3.8 mL、3.6 mL、3.4 mL、3.2 mL、3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL的95%乙醇溶液后混合均勻，在λ=520 nm測吸光度作為空白校正Aj值。以蘆丁作為陽性對照。按下式計算自由基清除率K值。

K（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

2 結(jié)果與分析

表1結(jié)果顯示，球花石斛乙醇提取物及其不同溶劑萃取部分對DPPH自由基的清除率隨著量的加大有逐步增強的趨勢；但不同提取物自由基清除作用差別較大，乙酸乙酯萃取部分相對其它提取物清除率略高。

從表2中可看出，球花石斛的乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除活性IC50值比其它提取物的IC50值小，表現(xiàn)了較強的自由基清除活性，但比蘆丁弱。

表1 球花石斛提取物DPPH自由基清除率

表2 球花石斛提取物清除DPPH自由基活性的IC50值

3 討論

研究表明，球花石斛的乙酸乙酯提取物活性較好，自由基清除IC50為0.11 mg/mL，進(jìn)一步研究該部分化學(xué)成分，可能得到自由基清除活性較強的化合物。筆者首次用DPPH自由基清除活性研究方法對球花石斛不同溶劑提取物自由基清除活性進(jìn)行研究，該研究為其研究開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。在此研究基礎(chǔ)上，筆者將進(jìn)一步采用新的藥理活性篩選方法跟蹤，分離得到新的活性成分。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985.

［2］陳心啟，吉占和，羅毅波.中國野生蘭科植物彩色圖鑒［M］.北京：科學(xué)出版社，1998，

［3］張光濃，張朝鳳，王崢濤，等.球花石斛的化學(xué)成分研究［J］.中國天然藥物，2004，2（2）：78-81.

［4］張光濃，張朝鳳，羅英，等.球花石斛的化學(xué)成分研究［J］.中國天然藥物，2005，3（5）：287-290.

［5］Wrigleyt C.Ayapin.scopoletin and 6，7-dimethoxy coumarin from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Nature，1960，188：1108.

［6］Liu YY，Yu H，Chen YG.CHEMICALCONSTITUENTSOFDendrobiumthyrsiflorum［J］.Chemistry of Natural Compounds，2011，47（2）：275-276.

［7］Zhang GN，Zhong LY，Annie Bligh SW，et al.Bi-bicyclic and bi-tricyclic compounds from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Phytochemistry，2005，66：1113-1120.

［8］鄭艷，徐珞珊，王崢濤，等.球花石斛莖中香豆素類成分的定位與相對定量［J］.藥學(xué)學(xué)報，2005，40（3）：236-240.

［9］鄭艷，徐珞珊，王崢濤，等.香豆素類成分在球花石斛根中的分布和相對含量［J］.激光生物學(xué)報，2005，14（2）：87-90.

［10］張光濃，張勉，史永鋒，等.HPLC-UV測定球花石斛中濱蒿內(nèi)酯和澤蘭內(nèi)酯含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（5）：388-391.

［11］宋寧，陸瑛，邱明華.球花石斛多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18：445-448.

［12］文小玲，俆俊駒，陳麗君，等.云南藥用植物束花石斛提取物體外抗氧化活性研究［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，35：4-5.

2014-07-14

國家自然科學(xué)基金資助項目（21202066）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃基金資助項目（2012FB156）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（2013C247）；云南省天然藥物藥理重點實驗室開放研究基金資助項目（2013G009）。

張凱麗（1991-），女，碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)成分和藥理活性研究。

*為通訊作者：李玉鵬，男，碩士研究生導(dǎo)師，副教授，主要從事天然藥物化學(xué)成分和藥理活性研究，E-mail：liyupeng26@126.com。