范秀麗 卞翠翠 董 怡 楊 雷 姜 艷 岳 清 陳濤利 劉子玲

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

腫瘤干細(xì)胞(CSC)在腫瘤細(xì)胞中所占比例極少，具有自我更新和多向分化潛能、高致瘤性、放化療抵抗性以及高侵襲性，可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移〔1，2〕。除常用的CD44、CD117和CD133等CSC表面標(biāo)志外，乙醛脫氫酶1(ALDH1)日益受到關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為肺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及頭頸部癌等多種 CSC 標(biāo)志〔3，4〕，ALDH1作為卵巢癌干細(xì)胞的標(biāo)志及其臨床意義的研究較少，本研究以卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)細(xì)胞為研究對(duì)象，研究 ALDH1在卵巢癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Aldefluor試劑、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、B27、CD133、順鉑。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng) 卵巢癌 SKOV3細(xì)胞株為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)液，37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均2～3 d換液、傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，當(dāng)大量細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大時(shí)加入完全培養(yǎng)液終止消化，用吹打管輕輕吹打細(xì)胞，離心后重懸，使細(xì)胞為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人卵巢癌懸浮細(xì)胞球的培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 SKOV3細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，無血清培養(yǎng)液(SFM)重懸，制成單細(xì)胞懸液，取2×105個(gè)細(xì)胞，接種于無血清加細(xì)胞因子(DMEM/F12+B27+EGF+bFGF)培養(yǎng)液。取6～7 d生長(zhǎng)的細(xì)胞球，離心后0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，進(jìn)行第2、3、4代傳代，觀察計(jì)數(shù)。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及懸浮細(xì)胞球的體外增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌SKOV3細(xì)胞及第2代培養(yǎng)6～7 d的懸浮細(xì)胞球，0.25%胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞，接種于96孔板。同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔調(diào)零。共 7 塊培養(yǎng)板分別標(biāo)記 1、2、3、4、5、6、7 d。按照標(biāo)記每天取1塊板，每孔加入20 μ(15 mg/ml)的MTT。37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加樣器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，室溫?fù)u床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。以空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小，各細(xì)胞亞群取8孔平均值。重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線，比較懸浮細(xì)胞球及SKOV3細(xì)胞體外增殖能力。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取SKOV3細(xì)胞及第2代培養(yǎng)至第6～7天的懸浮細(xì)胞球，制備單細(xì)胞懸液，每孔200個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，每種細(xì)胞接種2孔。十字形輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，加入完全培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 w，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，室溫下干燥。甲醛固定15 min，棄去甲醛，干燥后用結(jié)晶紫染液染色5 min，流水緩慢洗去染液，干燥后顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式(平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù) ×100%)計(jì)算平板克隆形成率。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用同樣方法制備單細(xì)胞懸液后接種細(xì)胞:在24孔板下室中加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μl，放入已鋪膠的小室。加 200 μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細(xì)胞，小室底膜下室側(cè)附著的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。

1.2.6 Hoechst33342染液和Aldefluor染液雙染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶(含 0.01%EDTA)消化，1 000 r/min離心后重懸。蓋玻片置于6孔板中，2×105個(gè)細(xì)胞沿6孔板的側(cè)壁緩慢將細(xì)胞接種于板中，保證細(xì)胞均勻分散，加入培養(yǎng)液，過夜待細(xì)胞爬滿蓋玻片。棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2次，然后加入Hoechst44432染液，終濃度為10 μg/ml，避光，37℃孵育 15 min后棄去染液。Aldefluor試劑盒專用buffer沖洗 2次，加入 10 μl Aldefluor染色劑，37℃避光孵育45 min。暗室冰上棄去培養(yǎng)液，4℃PBS沖洗2次。封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè) SKOV3細(xì)胞及懸浮細(xì)胞球 ALDH1high、CD133的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞及傳至第2代生長(zhǎng)至第6～7天懸浮細(xì)胞球，胰蛋白酶消化后1 000 r/min離心，4℃PBS沖洗2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。取 EP管，分別標(biāo)記SKOV3細(xì)胞組和懸浮細(xì)胞球組及各自對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，取1×106個(gè)細(xì)胞加入相應(yīng)的 EP管中，各實(shí)驗(yàn)組加入5 μl CD133抗體，對(duì)照組不加，室溫避光，孵育 30 min后，PBS沖洗1遍，置于冰上，待流式儀檢測(cè)。另外取離心后細(xì)胞，Aldefluor buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1×106/ml，同樣標(biāo) SKOV3細(xì)胞組和懸浮細(xì)胞球組，并分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組EP管中分別加入1 ml細(xì)胞懸液，在對(duì)照組 EP管中加入5 μl對(duì)二乙氨苯甲醛(DEAB)抑制劑，迅速蓋好 EP管的蓋子(DEAB溶解于95%的酒精里，應(yīng)防止揮發(fā))。實(shí)驗(yàn)組中加入5 μl活化的 Aldefluor，混勻后，立即轉(zhuǎn)移 0.5 ml混合液到對(duì)照組中(加 DEAB的試管)。因ALDH酶促反應(yīng)迅速，在加入 Aldefluor試劑后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移0.5ml到加DEAB的對(duì)照EP管中。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EP管37℃孵育45 min后，1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，Aldefluor緩沖液重懸細(xì)胞，后置于冰上。待流式細(xì)胞儀分析ALDH1high細(xì)胞比例。

1.2.8 體外化療實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組加入1 mg/ml的順鉑，培養(yǎng)72 h后撤藥。對(duì)照組加入相同體積的 PBS。撤藥后，PBS沖洗3次，0.25%胰蛋白酶消化液將細(xì)胞消化下來計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取1×106個(gè)細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化后，按1.2.7步驟進(jìn)行 Aldefluor、CD133標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌SKOV3細(xì)胞懸浮球 卵巢癌 SKOV3細(xì)胞，在體外貼壁上皮樣生長(zhǎng)，短梭形，可伸出不規(guī)則樹突樣偽足，胞漿內(nèi)可見空泡樣顆粒。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌SKOV3細(xì)胞接種于無血清加細(xì)胞因子培養(yǎng)基中，大多數(shù)細(xì)胞死亡，小部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，并很少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但隨著培養(yǎng)天數(shù)增加貼壁細(xì)胞消失。3～4 d可見少量細(xì)胞組成的懸浮細(xì)胞球，球體較少，其大小不等，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞結(jié)合松散;第6～7天，懸浮細(xì)胞球增多，細(xì)胞結(jié)合緊密，球體增大，折光性好，形態(tài)變得規(guī)則。懸浮細(xì)胞球經(jīng)0.25%的胰蛋白酶(含 0.01%EDTA)消化3min后，重懸于SFM中培養(yǎng)，3～4 d左右仍可見不規(guī)則細(xì)胞球形成，6～7 d細(xì)胞球形態(tài)較規(guī)則，可以多次傳代培養(yǎng)。見圖1。

圖1 無血清培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3懸浮細(xì)胞球

2.2 增殖克隆能力分析 MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及懸浮細(xì)胞球的自我增殖及克隆形成能力。連續(xù)檢測(cè)懸浮細(xì)胞球和SKOV3細(xì)胞7 d的OD值，第1～2天，OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第3天開始OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果:細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)約2 w后，顯微鏡下觀察多數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)＞50，按公式:平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，計(jì)算克隆形成率，懸浮細(xì)胞球和SKOV3細(xì)胞的克隆形成率分別為35.23±5.89%、20.32±6.42%。兩組細(xì)胞克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 MTT檢測(cè)懸浮細(xì)胞球和SKOV3細(xì)胞7 d的OD值(s)

表1 MTT檢測(cè)懸浮細(xì)胞球和SKOV3細(xì)胞7 d的OD值(s)

時(shí)間 懸浮細(xì)胞球 SKOV3細(xì)胞 P值0.109±0.002 0.109±0.001 0.100第2天 0.194±0.016 0.190±0.023 0.394第3天 0.384±0.010 0.325±0.065 0.010第4天 0.504±0.075 0.454±0.042 0.001第5天 0.760±0.031 0.540±0.065 0.001第6天 0.844±0.094 0.653±0.091 0.009第7天第1天1.075±0.134 0.848±0.079 0.003

2.3 侵襲能力分析 通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)懸浮細(xì)胞球細(xì)胞及SKOV3細(xì)胞的侵襲能力，任選5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:懸浮細(xì)胞球細(xì)胞穿過膜數(shù)為237±37.42，SKOV3細(xì)胞穿膜數(shù)為87.8±32.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察卵巢癌SKOV3細(xì)胞中的ALDH1表達(dá) 倒置顯微鏡下，SKOV3細(xì)胞成多角梭形，少數(shù)細(xì)胞中可見多核，核質(zhì)比例增大，ALDH1定位于 SKOV3細(xì)胞的胞質(zhì)，鏡下可見多數(shù) SKOV3細(xì)胞胞質(zhì)為綠色熒光，但熒光強(qiáng)度很弱;ALDH1活性越高，其胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的熒光底物就越多，細(xì)胞熒光強(qiáng)度就越強(qiáng)。經(jīng)Hoechst 33342和 Aldeflour雙染后，SKOV3細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)區(qū)和細(xì)胞核區(qū)熒光強(qiáng)弱對(duì)比明顯。SKOV3細(xì)胞核經(jīng) Hoechst 33342染色后顯示為藍(lán)色熒光，而 ALDH1high細(xì)胞核不被染色。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) ALDH1high細(xì)胞、CD133+細(xì)胞比例 應(yīng)用Aldeflour試劑流式細(xì)胞技術(shù)分析卵巢癌SKOV3細(xì)胞及懸浮細(xì)胞球結(jié)果顯示，ALDH1high細(xì)胞為綠色熒光，在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中所占比例較低，僅占4.08±0.29%，CD133+細(xì)胞比例為1.21±0.34%。無血清懸浮培養(yǎng)傳至第2代培養(yǎng)6～7 d懸浮細(xì)胞球流式檢測(cè)結(jié)果顯示，ALDH1high細(xì)胞的比例為 22.42±2.42%，CD133+細(xì)胞比例為10.34±0.17%，在懸浮細(xì)胞球中ALDH1high細(xì)胞、CD133+細(xì)胞比例明顯增高，與普通培養(yǎng)的 SKOV3細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 體外化療實(shí)驗(yàn) 順鉑連續(xù)作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞72 h后撤藥，10%胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后流式檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1high、CD133+細(xì)胞比例明顯增加，分別為17.25% ±3.26%和4.04% ±0.86%，ALDH1high細(xì)胞比例增加了3.23倍，CD133+細(xì)胞比例增加了2.34倍，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

ALDH1屬ALDH家族之一。人類的ALDH1基因表達(dá)存在于細(xì)胞質(zhì)中，其基因定位于9q21染色體，是催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，并通過氧化視黃醇為視黃酸參與多種組織的分化與基因表達(dá)。研究顯示ALDH1在多種組織類型的CSC高表達(dá)，而高表達(dá)ALDH1的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。目前，ALDH1已作為功能性標(biāo)志物應(yīng)用于多種實(shí)體CSC的分離和鑒定，證實(shí)了ALDH1在腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用。

Martens等〔5〕利用無血清加EGF和bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)正常腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) bFGF反應(yīng)性細(xì)胞在 bFGF作用下進(jìn)行自我更新，并生成具有EGF反應(yīng)性的干細(xì)胞，而EGF反應(yīng)性干細(xì)胞在EGF作用下進(jìn)行自我增殖，并通過不對(duì)稱分裂來生成具有bFGF反應(yīng)性的神經(jīng)干細(xì)胞，因此只有干細(xì)胞才能在SFM中生長(zhǎng)，而大部分細(xì)胞死亡。

依據(jù)卵巢癌干細(xì)胞不同的標(biāo)志及干細(xì)胞特性在卵巢癌組織、腹水和卵巢癌細(xì)胞系中均分離出了干細(xì)胞樣細(xì)胞，現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道的可作為卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)志物有CD133、CD44、CD117、CD24等。ALDH1在多種CSC中高表達(dá)，ALDH1首先被用于白血病干細(xì)胞的分離與鑒定〔6〕。Landen等〔7〕研究證實(shí) ALDH1在卵巢腫瘤組織及細(xì)胞系中均有表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞系中分離出的ALDH1+細(xì)胞比陰性細(xì)胞更具有化療抵抗性及致瘤性。另外一項(xiàng)研究證實(shí)在紫杉醇和順鉑耐藥的細(xì)胞中 ALDH1高表達(dá)，在卵巢癌耐藥A2780細(xì)胞株中分離出的ALDH1+陽(yáng)性細(xì)胞的致瘤能力是ALDH1－細(xì)胞的50倍，ALDH1+細(xì)胞可產(chǎn)生ALDH1+和 ALDH1－細(xì)胞，而 ALDH1－細(xì)胞卻不能產(chǎn)生 ALDH1+細(xì)胞〔7〕，這些特性與CSC的特性一致。Silva研究發(fā)現(xiàn) ALDH聯(lián)合CD133能更加有效的分離卵巢癌干細(xì)胞，ALDH+CD133+細(xì)胞比ALDH+CD133－細(xì)胞具有更強(qiáng)的異體移植成瘤能力，且ALDH+CD133+細(xì)胞可分化為 ALDH+/-CD133+/－四種類型的細(xì)胞，而無論來自腫瘤組織或者是細(xì)胞系的CD133－細(xì)胞均不能分化為CD133+細(xì)胞〔8〕。本研究結(jié)果顯示ALDH1high細(xì)胞比例是CD133+細(xì)胞比例的2倍以上。懸浮細(xì)胞球高表達(dá)CSC標(biāo)志CD133，因此說明了懸浮細(xì)胞球富集了大量干細(xì)胞，本研究為懸浮細(xì)胞球中干細(xì)胞數(shù)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。無論是CD133+細(xì)胞還是ALDH1high細(xì)胞均在懸浮細(xì)胞球中富集，說明ALDH1high細(xì)胞和CD133+細(xì)胞一樣，可作為卵巢癌干細(xì)胞的標(biāo)志。

ALDH1不僅可作為CSC的標(biāo)志，而且還提示預(yù)后不良，與腫瘤細(xì)胞耐藥有一定的關(guān)系。Kryczek等〔9〕通過基因敲除發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中 ALDH1A1和 ALDH3A1與環(huán)磷酞胺耐藥有關(guān)。而卵巢癌細(xì)胞系中敲出ALDH1基因可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性〔10〕。通過分析多種卵巢癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇和鉑類耐藥細(xì)胞株中 ALDH1高表達(dá)，并且在臨床標(biāo)本中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與患者無進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān)〔7〕。本研究結(jié)果可知ALDH1high細(xì)胞和CD133+細(xì)胞比陰性細(xì)胞更具生存能力，因此化療后 ALDH1high細(xì)胞和 CD133+細(xì)胞得到富集。ALDH1high細(xì)胞比例增加幅度高于 CD133+細(xì)胞，這可能提示ALDH1high細(xì)胞耐藥性高于CD133+細(xì)胞，也可能提示在卵巢癌干細(xì)胞分化等級(jí)中 ALDH1high細(xì)胞和CD133+細(xì)胞處于不同等級(jí)，但仍需更多的研究證實(shí)。

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