鞏忠萍，杜夢圓，宋 笛，高蕻冰，杜浩然，于莉莉，吳 江，呂奎霖，葛爭紅，石春卉，李 燁，呂玉光

(1.佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江佳木斯，154007;2.佳木斯大學(xué) 國際教育學(xué)院，黑龍江佳木斯，154007;3.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯，154002;4.北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京100029;5.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100101)

環(huán)丙沙星作為第3代喹諾酮類藥物的典型代表之一，具有抗菌譜廣，毒副作用小，血藥濃度高，半衰期長，制劑形式多樣，藥效價格比高等特點［1］，使其廣泛應(yīng)用于臨床治療中.與此同時發(fā)展出了一系列的檢測環(huán)丙沙星方法，例如有分光光度法［2－3］、高效液相色譜法［4－6］和熒光光度法［7］.在 Mulliken 等［8］首次提出了電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物理論后，許多人對這一理論進(jìn)行了深入的研究.電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物(charge transfer complex，CTC)是由富含電子的分子和缺電子物質(zhì)之間通過電荷轉(zhuǎn)移而構(gòu)成的絡(luò)合物［9］.由于許多藥物中含有富電子基團(tuán)(氨基、吡啶等)，因此能夠與電子受體(四氰基乙烯等)形成穩(wěn)定的荷移絡(luò)合物［10］，且基于此理論方法進(jìn)行的藥物定量分析法具有簡便準(zhǔn)確，靈敏度高等特點［11－12］.應(yīng)用荷移反應(yīng)對喹諾酮類藥物含量測定的方法研究多限于分光光度法［13］，而采用熒光光譜對喹諾酮類藥物荷移反應(yīng)的研究還很少被報道.

基于此，選取四氰基乙烯為電子受體試劑來和環(huán)丙沙星構(gòu)筑荷移絡(luò)合物，研究其最佳合成條件.通過體系的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，建立了新型的檢測環(huán)丙沙星藥物的新方法.同時，還對其荷移絡(luò)合物的形成機(jī)理進(jìn)行了研究.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

970CRT熒光分光光度計(上海儀器分析制作總廠);UV/Vis－265紫外－可見光分光光度計;環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取10 mg的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號:00120000，純度≥99.0%)，加少量甲醇溶解，配置成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時逐級稀釋至所需濃度;四氰基乙烯標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確稱取64 mg四氰基乙烯標(biāo)準(zhǔn)品，加少量丙酮溶解，配置成5×10－3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液;所用其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在10 mL具塞比色管中用移液管準(zhǔn)確吸取適量環(huán)丙沙星甲醇溶液，然后分別加入2.5mL的四氰基乙烯工作液，然后用無水甲醇定容至刻度線，充分搖勻.將其置于40℃的恒溫水浴箱中加熱40 min.冷卻至室溫.將樣品置于熒光比色池中，以331 nm為激發(fā)波長，與437 nm處測量荷移絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度.以同樣的方法進(jìn)行空白試驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)丙沙星荷移反應(yīng)前后的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜和紫外光譜

按實驗方法配制試液，分別對所得荷移反應(yīng)產(chǎn)物和環(huán)丙沙星和空白試劑進(jìn)行熒光激發(fā)和發(fā)射掃描(見圖1).由圖1可知，環(huán)丙沙星自身能發(fā)射熒光.當(dāng)與四氰基乙烯發(fā)生荷移反應(yīng)后，熒光激發(fā)和發(fā)射峰的位置變化不大，但熒光強(qiáng)度卻顯著增強(qiáng)，這表明環(huán)丙沙星與四氰基乙烯荷移絡(luò)合物的生成.

按實驗方法配置溶液后，在UV/Vis－265分光光度計上掃描，繪制吸收光譜如圖2所示，表明絡(luò)合物在409 nm處有最大吸收峰，而TCNE和CPFX的最大吸收峰分別位于328 nm和327 nm，說明了荷移絡(luò)合物的形成.

2.2 四氰基乙烯用量的影響

分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的四氰基乙烯加入到含有4 mL環(huán)丙沙星的比色管中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，40℃水浴中保溫40 min，冷卻至室溫，測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示.實驗結(jié)果表明:當(dāng)四氰基乙烯的用量在0.3 mL時熒光增強(qiáng)最大.用量過低則反應(yīng)不完全;而用量高時導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降.

2.3 環(huán)丙沙星用量的影響

分別取 1，2，3，4，5，6，7，8 mL 的環(huán)丙沙星溶液到含有0.3 mL四氰基乙烯的比色管中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，40℃水浴中保溫40 min，冷卻至室溫，測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示.實驗結(jié)果表明:當(dāng)環(huán)丙沙星的用量在4 mL時熒光增強(qiáng)最大.

2.4 反應(yīng)溫度的影響

按實驗方法，在固定其他實驗條件不變的情況下，考察溫度對熒光強(qiáng)度的方法.選取最佳的試劑質(zhì)量濃度分別加至不同的比色管中，然后置于不同的恒溫水浴鍋中，控制溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃加熱40 min.結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明當(dāng)溫度處于40℃以下時，體系的熒光強(qiáng)度隨著溫度的增高而依次增強(qiáng).但在40℃后體系的熒光強(qiáng)度逐漸穩(wěn)定.本實驗選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度.

2.5 反應(yīng)時間的影響

選取確定的最佳實條件，考察反應(yīng)時間對荷移絡(luò)合物的影響.選取最佳反應(yīng)質(zhì)量濃度的試劑置于不同比色管中，控制溫度在40℃，反應(yīng)時間分別為10、20、30、40、50、60 min，其熒光強(qiáng)度變化如圖 6 所示，環(huán)丙沙星與四氰基乙烯發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)最佳反應(yīng)時間為40 min.

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

準(zhǔn)確配置質(zhì)量濃度為1.0～100 mg/L的環(huán)丙沙星溶液，按上述建立的實驗方法，對不同質(zhì)量濃度的荷移絡(luò)合物體系進(jìn)行熒光光譜掃描，選取最佳的實驗條件，結(jié)果表明環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度－熒光強(qiáng)度曲線中當(dāng)環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度為0.2～8.1 mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F=139.2ρ+2.564 1;相關(guān)系數(shù)r=0.999 4;檢出限為0.2 mg/L.

2.7 反應(yīng)機(jī)理初探

四氰基乙烯是一個很強(qiáng)的平面型π電子受體，而環(huán)丙沙星分子中的哌嗪基上的氮原子有一對孤對電子，可作為電子供體，與四氰基乙烯形成1∶1的n－π型荷移絡(luò)合物，其形成過程可表示如圖7所示.

3 樣品分析

在丙酮－甲醇介質(zhì)中，環(huán)丙沙星能與四氰基乙烯形成穩(wěn)定的電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物，最佳的反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為40 min，其熒光強(qiáng)度較環(huán)丙沙星有顯著的提高.因此，該法可作為用于測定藥物中環(huán)丙沙星的含量的新方法，且反應(yīng)條件溫和，速度快，靈敏度高.

3.1 待測樣品溶液的配置

分別取2個不同廠家生產(chǎn)的鹽酸環(huán)丙沙星片劑10片，經(jīng)過準(zhǔn)確稱量記錄后，研成粉末狀.準(zhǔn)確稱取其總質(zhì)量的1/10，用甲醇溶液溶解，精密稱取濾液5 mL，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，備用.

3.2 樣品測定及回收率

分別量取適量的鹽酸環(huán)丙沙星樣品溶液，置于10 mL比色管中，按照上述實驗所確定的最佳條件和方法，計算出樣品實際含量.準(zhǔn)確量取適量的鹽酸環(huán)丙沙星對照品，通過熒光強(qiáng)度來計算回收率，結(jié)果表1所示.

本方法和藥典法無系統(tǒng)誤差，回收檢驗結(jié)果令人滿意，其回收率為97.69% ～100.12%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%.

4 結(jié)語

在丙酮－甲醇介質(zhì)中，環(huán)丙沙星能與四氰基乙烯形成穩(wěn)定的電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物，最佳的反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為40 min，其熒光強(qiáng)度較環(huán)丙沙星有顯著的提高.因此，該法可作為用于測定藥物中環(huán)丙沙星的含量的新方法，且反應(yīng)條件溫和，速度快，靈敏度高.

表1 鹽酸環(huán)丙沙星片劑分析結(jié)果(n=5)

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