何 珊，常 宏，劉大艷，鄧少潔，樊丹怡(.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳 58028;2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 58028)

目前，全球不孕癥的發(fā)病率逐年升高，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)是目前不孕癥的最主要治療手段之一。在“腎主生殖”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，把補(bǔ)腎益精為基礎(chǔ)的中醫(yī)治療思想引入IVF技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)中，通過(guò)控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)技術(shù)獲得多個(gè)優(yōu)質(zhì)卵子是IVF成功的關(guān)鍵，補(bǔ)腎調(diào)周法在協(xié)同COH方面起著重要作用，但具體作用機(jī)制尚不明確［1-2］。CYP19基因是芳香化酶P450(P450arom)的編碼基因，P450arom使雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇(E2)，可刺激自身受體及黃體生成素受體的合成，在卵泡募集的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，也是卵巢內(nèi)部局部調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要因素之一［3］。目前還未見(jiàn)補(bǔ)腎調(diào)周法通過(guò)影響CYP19A1的表達(dá)而調(diào)節(jié)卵巢微環(huán)境及卵泡發(fā)育的報(bào)道。本研究觀察了補(bǔ)腎調(diào)周法對(duì)COH患者體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞CYP19A1 mRNA表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)水平探討中醫(yī)補(bǔ)腎調(diào)周法對(duì)卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟的作用機(jī)制，并為驗(yàn)證此法的有效性提供科學(xué)、客觀的試驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選擇2014年4—6月在深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心因輸卵管因素不孕接受IVF-ET治療的患者80例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:治療組(育泡組方聯(lián)合COH治療)12例，其中2例患者未按規(guī)定用藥，退出研究;對(duì)照組(COH治療)12例，有1例降調(diào)后妊娠，取消周期。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

中醫(yī)腎虛證不孕的辨證標(biāo)準(zhǔn):(1)月經(jīng)量少或質(zhì)稀;(2)腰骶酸痛;(3)脛酸膝軟或足跟痛;(4)頭暈耳鳴;(5)性欲淡漠;(6)兩尺脈沉遲緩［4］。以上6條具備3條即可診斷。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):符合輸卵管性不孕的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):符合西醫(yī)輸卵管性不孕的診斷標(biāo)準(zhǔn);符合中醫(yī)腎虛辨證標(biāo)準(zhǔn);男方精液檢查正常;年齡≤35歲;卵巢儲(chǔ)備功能正常;子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm、首次接受 IVF-ET［5］。排除標(biāo)準(zhǔn):患有先天性生理缺陷或畸形;子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜息肉等內(nèi)膜病變、子宮發(fā)育不良等;多囊卵巢綜合征;輸卵管積水;遺傳和免疫因素等所致不孕;對(duì)研究藥物過(guò)敏者。

1.4 方法

1.4.1 治療方法:治療組10例患者給予育泡組方(主要由補(bǔ)腎益精類(lèi)中藥組成，包括紫河車(chē)、菟絲子、熟地黃、枸杞子、當(dāng)歸等)聯(lián)合COH治療;對(duì)照組11例患者給予COH治療。

1.4.2 儀器與試劑:超速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，Thermo 702型超低溫冰箱(美國(guó) Thermo公司)，EPS-300型電泳儀(上海天能科技有限公司)，Bio-Rad Mycycler PCR儀、凝膠成象系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);Trizol試劑(美國(guó)SIGMA公司)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)所需試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，引物合成購(gòu)自南京金思瑞生物技術(shù)公司。

1.4.3 COH方案:采用黃體期長(zhǎng)方案進(jìn)行COH治療。在治療前一周期的黃體中期給予長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑進(jìn)行降調(diào)節(jié)，當(dāng)達(dá)到完全降調(diào)節(jié)時(shí)，開(kāi)始給予注射重組型卵泡刺激素(recombinant FSH，rFSH)。通過(guò)B型超聲檢查和血E2的測(cè)定，監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，調(diào)整rFSH的劑量。當(dāng)B超監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm，或有2個(gè)卵泡直徑≥17 mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)5000～10000 IU，促使卵泡成熟。34～36 h后，在靜脈麻醉狀態(tài)、B超引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺取卵術(shù)，并立即在顯微鏡下取出卵細(xì)胞，移至含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.4 分離顆粒細(xì)胞:將取卵后的卵泡液經(jīng)2000 r/min離心10 min，去上清液。細(xì)胞沉淀物用磷酸鹽緩沖液配成懸液，以1∶1(V∶V)的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上。以2000 r/min離心30 min，吸取顆粒細(xì)胞層，用紅細(xì)胞裂解液洗滌、溶解紅細(xì)胞。最后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌去除紅細(xì)胞裂解液，用Trizol試劑分離蛋白，置－80℃冰箱保存。

1.4.5 半定量RT-PCR法測(cè)定CYP19A1 mRNA的表達(dá):應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢低反應(yīng)組、正常反應(yīng)組和高反應(yīng)組顆粒細(xì)胞中CYP19A1 mRNA的表達(dá)，顆粒細(xì)胞總RNA的提取、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(第一鏈的合成)采用試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。PCR反應(yīng)體系:ddH2O 3.6 μl，2×PCR Mix 5 μl，Primerl 0.2 μl，Primer20.2 μl，cDNA 1 μl;PCR 循環(huán)參數(shù):30個(gè)循環(huán)完成，94℃充分變性4.5 min，54℃退火40 s以及72℃延伸40 s，結(jié)束循環(huán)后再72℃充分延伸7 min;PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)行光密度掃描半定量，以CYP19A1與內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)密度掃描值之比作為評(píng)價(jià)CYP19A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 Primer sequences and product length of PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()或率(%)表示，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性用Spearman相關(guān)系數(shù)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床資料及IVF參數(shù)比較

2組患者年齡、不孕年限、體質(zhì)重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、竇卵泡數(shù)、HCG日E2水平及獲卵數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2組患者rFSH使用時(shí)間、rFSH總用量、E2/獲卵數(shù)、MⅡ卵子數(shù)/獲卵數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，治療組rFSH使用時(shí)間和rFSH總用量減少，而單個(gè)卵泡雌激素水平、成熟卵子率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于對(duì)照組，見(jiàn)表2。

表2 2組患者臨床資料及IVF參數(shù)比較()Tab 2 Clinical data and IVF parameters in two groups()

表2 2組患者臨床資料及IVF參數(shù)比較()Tab 2 Clinical data and IVF parameters in two groups()

項(xiàng)目 治療組(n=10) 對(duì)照組(n=11) P值32.1±4.7 31.6±4.2 1.000不孕年限/年 3.7±2.3 3.9±2.7 0.942體質(zhì)重指數(shù)/(kg/m2) 22.5±3.3 21.8±3.7 0.893基礎(chǔ)FSH/(IU/L) 7.2±2.6 6.9±2.3 0.739竇卵泡數(shù)/個(gè) 11.7±2.8 12.1±2.3 0.639 rFSH使用時(shí)間/d 10.5±1.8 12.4±2.1 0.047 rFSH總用量/IU 2058.0±568.5 2454.8±623.8 0.038 HCG日E2水平/(pg/ml) 3253.5±1043.6 3165.8±1182.5 0.642 E2/獲卵數(shù) 295.8±94.5 263.7±68.9 0.049獲卵數(shù)/個(gè) 11.1±3.7 12.2±3.2 0.783 MⅡ卵子數(shù)/獲卵數(shù) 84.6±6.3 75.7±7.1 0.036優(yōu)質(zhì)胚胎率年齡/歲/% 75.2±5.7 66.5±6.2 0.043

2.2 2組患者治療前后腎虛證候積分變化比較

COH治療前，治療組患者(n=10)腎虛證候積分為(10.8±2.7)分，對(duì)照組(n=11)為(10.6±2.3)分，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);COH治療后，治療組患者腎虛癥狀明顯改善，腎虛證候積分為(7.2±2.1)分，而對(duì)照組患者腎虛證候積分反而較治療前升高，為(11.5±2.9)分，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 2組患者卵巢顆粒細(xì)胞CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2組患者卵巢顆粒細(xì)胞提取RNA經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳，在503 bP顯示GAPDH內(nèi)參條帶，在442 bP顯示CYP19A1條帶，見(jiàn)圖1。治療組患者卵巢顆粒細(xì)胞CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.41±0.06，明顯高于對(duì)照組的0.22±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與IVF參數(shù)相關(guān)性分析

CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與MⅡ卵子數(shù)/獲卵數(shù)及E2/獲卵數(shù)呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.431，r=0.336，P＜0.05)，與rFSH總用量、rFSH使用時(shí)間及獲卵數(shù)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表3。

表3 CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與IVF參數(shù)相關(guān)性分析Tab 3 Correlation between expression of CYP19A1 mRNA and IVF parameters

圖1 RT-PCR檢測(cè)2組細(xì)胞中CYP19A1 mRNA的表達(dá)情況Fig 1 mRNA expression of CYP19A1 of the two groups as detected by RT-PCR

3 討論

腎藏先天之精，得后天水谷精氣之養(yǎng)，化生生殖之精，藏于腎中，為腎主生殖之根本和基礎(chǔ)。隨著先、后天精氣互資互充，腎中精氣漸盛，產(chǎn)生天癸。在女子，卵泡“二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，故有子”。腎中先天之精是產(chǎn)生生殖之精的物質(zhì)基礎(chǔ)，卵母細(xì)胞的生成、發(fā)育、成熟均以腎所藏精氣為物質(zhì)基礎(chǔ)，腎中精氣不足是卵泡發(fā)育障礙的基本病機(jī)。超排卵的過(guò)程中，短時(shí)間內(nèi)卵泡急速發(fā)育，天癸大量泌至，耗損腎之陰陽(yáng)，造成腎中精、氣、血的相對(duì)不足，形成腎虛為本的證候群［4］。補(bǔ)腎調(diào)周法遵循中醫(yī)“天人合一”思想，補(bǔ)腎為主，結(jié)合行氣活血補(bǔ)血，從宏觀上總體協(xié)調(diào)機(jī)體的內(nèi)分泌環(huán)境，提高排卵細(xì)胞質(zhì)量［5］。何嘉林教授認(rèn)為，補(bǔ)腎調(diào)周有助于改善卵巢的儲(chǔ)備功能，提高促排卵周期卵巢的敏感性，增加獲卵數(shù)，改善卵子質(zhì)量，提高種植率和妊娠率［6］。馬景蘭等［7］將滋腎填精、行氣活血的“助孕丸”配合COH方案應(yīng)用于IVF中，發(fā)現(xiàn)“助孕丸”組患者卵細(xì)胞成熟度、移植前卵泡評(píng)分、獲卵數(shù)、形成胚胎數(shù)均優(yōu)于對(duì)照組，說(shuō)明“助孕丸”能提高卵子和胚胎質(zhì)量，有利于提高妊娠率。連方等［8］應(yīng)用補(bǔ)腎益天癸的二至天癸方干預(yù)促排卵周期的小鼠，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠卵子受精能力和早期胚胎分裂能力低于中藥組，且異常卵裂球所占比例較大，提示二至天癸方能減少促排卵藥對(duì)卵子發(fā)育、受精能力及卵裂能力的影響。本研究以補(bǔ)腎調(diào)周法為治療大法，根據(jù)IVF-ET的COH方案配以育泡組方(主要由補(bǔ)腎益精類(lèi)中藥組成，包括紫河車(chē)、菟絲子、熟地黃、枸杞子、當(dāng)歸等)。結(jié)果顯示，治療組患者腎虛癥狀明顯改善，對(duì)照組患者腎虛癥狀無(wú)明顯改善，反而增高;治療組患者rFSH使用時(shí)間和rFSH總用量減少，而單個(gè)卵泡雌激素水平、成熟卵子率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于對(duì)照組，與上述學(xué)者的研究結(jié)論一致，表明補(bǔ)腎調(diào)周系列方可改善促排卵周期卵母細(xì)胞的質(zhì)量，減少促性腺激素的用量和用藥時(shí)間。

從卵母細(xì)胞的募集到卵母細(xì)胞的成熟，顆粒細(xì)胞都起著重要的作用。顆粒細(xì)胞表面有豐富的受體并能分泌多種具有生物活性的激素，能特殊地表達(dá)P450arom［9］。卵母細(xì)胞本身不表達(dá)促性腺激素的受體，F(xiàn)SH受體僅存在于卵巢的顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞之間以及顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間通過(guò)廣泛的縫隙連接形成一個(gè)功能上的整體，它介導(dǎo)促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞的調(diào)節(jié)，同時(shí)通過(guò)自分泌或旁分泌作用，維持有利于卵母細(xì)胞成熟的微環(huán)境［10］。卵泡發(fā)育早期，顆粒細(xì)胞表面的FSH受體活性較強(qiáng)，F(xiàn)SH作用于顆粒細(xì)胞上的FSH受體，隨卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞對(duì)FSH敏感性逐漸增加。在超排卵的過(guò)程中，卵泡FSH與顆粒細(xì)胞膜受體結(jié)合后激活 CYP19基因，刺激P450arom轉(zhuǎn)錄，活化P450arom系統(tǒng)，雄激素透過(guò)基膜彌散轉(zhuǎn)運(yùn)至顆粒細(xì)胞，而后在活化的顆粒細(xì)胞P450arom催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?。P450arom是CYPl9基因的產(chǎn)物，也是E2生物合成中的關(guān)鍵酶和限速酶，其表達(dá)及其功能調(diào)節(jié)會(huì)使E2生成量發(fā)生顯著變化，其中CYP19A1基因位于染色體15q21.2區(qū)位，與血清雌激素水平息息相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，治療組患者CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與MⅡ卵子數(shù)/獲卵數(shù)及E2/獲卵數(shù)呈正相關(guān)，表明補(bǔ)腎益精類(lèi)中藥可以提高CYP19A1 mRNA的表達(dá)，改善顆粒細(xì)胞分泌功能，從而更有利于提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量、改善胚胎的質(zhì)量。

綜上所述，在IVF-ET治療周期中應(yīng)用補(bǔ)腎益精類(lèi)中藥，可明顯改善患者腎虛癥狀，減少rFSH用量，提高成熟卵子率及優(yōu)質(zhì)胚胎率。補(bǔ)腎益精類(lèi)中藥是臨床常用的有效藥物，可提高顆粒細(xì)胞CYP19A1 mRNA的表達(dá)，改善顆粒細(xì)胞分泌功能，這可能是其改善IVF結(jié)局的機(jī)制之一。

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