王 成，鄭志永，朱 莉，高敏杰，詹曉北

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 214125）

通氣量對(duì)氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸的影響

王 成1，2，鄭志永1，2，朱 莉3，高敏杰1，2，詹曉北1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 214125）

高山被孢霉具有很強(qiáng)的積累花生四烯酸（ARA）的能力，通過(guò)對(duì)30 L氣升式反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程的通氣量進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通氣量對(duì)高山被孢霉菌體生長(zhǎng)、形態(tài)及ARA合成具有顯著影響。中等大小的球形菌絲形態(tài)有利于菌體持續(xù)生長(zhǎng)和油脂積累，ARA占總油脂的含量最高，而羽狀菌絲形態(tài)菌體中總油脂含量和ARA含量均小于球形菌絲形態(tài)菌體中的含量。通氣量為1.0 vvm（1 vvm為每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積之比）時(shí)有利于菌體保持良好形態(tài)和生長(zhǎng)，通氣量為1.4 vvm有利于發(fā)酵對(duì)數(shù)期后（72～168 h）ARA的積累。提出一種兩階段通氣量控制策略，在氣升式發(fā)酵罐中高山被孢霉的菌絲形態(tài)得到顯著改善，ARA產(chǎn)量達(dá)到4.72 g/L，比對(duì)照提高了40.1%。

高山被孢霉；花生四烯酸；氣升式反應(yīng)器；通氣量

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），全稱二十碳-5，8，11，14-四烯酸（全順），是ω-6系列多不飽和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于機(jī)體各種組織的細(xì)胞膜上，具有多種生理活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。ARA是人體中前列腺素、血栓素和白三烯等重要物質(zhì)的前體物質(zhì)，對(duì)預(yù)防心血管疾病具有很好功效［1-2］，并且ARA可以作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰兒奶粉中，有助于提高嬰幼兒感光及認(rèn)知能力［3］。

ARA在成年人體內(nèi)合成量很少，在嬰幼兒體內(nèi)，因缺少相應(yīng)的酶而無(wú)法合成［4］。傳統(tǒng)ARA主要來(lái)源于蛋黃、動(dòng)物肝臟和腎上腺等，但動(dòng)物組織中ARA含量大多低于5%［5］，并且提取得到的為ARA粗品，含有大量的二十碳五烯酸，而過(guò)量的二十碳五烯酸會(huì)抑制ARA的吸收和合成，從而降低細(xì)胞中ARA水平，導(dǎo)致嬰幼兒大腦發(fā)育不成熟，甚至性早熟［6］。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA具有突出的優(yōu)勢(shì)：其不受原材料及氣候限制、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單并且含量高。因此，微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA已成為主流趨勢(shì)。高山被孢霉（Mortierella alpina）目前被認(rèn)為是發(fā)酵生產(chǎn)ARA的最佳菌株，其菌體中ARA含量豐富且不飽和脂肪酸組成合理［7-8］。

氣升式反應(yīng)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、剪切應(yīng)力小、能量耗散均勻和供氣效率高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)剪切力敏感的微生物培養(yǎng)具有重要意義［9］，用于ARA發(fā)酵有利于保持M.alpina菌體的優(yōu)勢(shì)形態(tài)，而菌體形態(tài)對(duì)總油脂及ARA的積累影響很大［10］。目前利用氣升式反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)ARA的文章鮮有報(bào)道，本文中筆者將考察氣升式反應(yīng)器重要操作參數(shù)——通氣量對(duì)M.alpina的生長(zhǎng)及合成 ARA的影響，以期提高ARA的發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 菌株

高山被孢霉 （Mortierella alpina）CFCC 88447，購(gòu)自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；pH自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，豆粕粉10，酵母膏 10，KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：初始葡萄糖50，豆粕粉10， KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0。

1.3 培養(yǎng)條件

種子液的制備：500 mL三角瓶中加入100 mL種子培養(yǎng)基，將M.alpina菌種接種到種子培養(yǎng)基中，25℃、110 r/min振蕩搖床培養(yǎng)48 h作為種子液備用。

氣升式反應(yīng)器恒速補(bǔ)料分批發(fā)酵條件：30 L氣升發(fā)酵罐（無(wú)錫市海信化機(jī)設(shè)備有限公司），接種量10%，裝液系數(shù)為0.6，通氣量0.8 vvm（1個(gè)vvm表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值），分批發(fā)酵時(shí)初始pH為6.0，使用2.0 mol/L NaOH維持發(fā)酵液pH為6.0±0.1，發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵開(kāi)始后，恒速 （6.12 mL/h）流加補(bǔ)料液 （700 g/L葡萄糖）直至發(fā)酵7 d結(jié)束。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測(cè)定

準(zhǔn)確量取50 mL發(fā)酵液進(jìn)行真空過(guò)濾（直徑7 cm中速定量濾紙），用蒸餾水沖洗至流出液無(wú)色，將菌體置于培養(yǎng)皿中，105℃下烘干至恒質(zhì)量，稱菌體干質(zhì)量。生物量計(jì)算公式：生物量=菌體干質(zhì)量/發(fā)酵液體積。

1.4.2 菌球直徑的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取2 mL搖勻后的發(fā)酵液倒入培養(yǎng)皿中，加入20 mL去離子水，稀釋后從中隨機(jī)選取30個(gè)菌球，以游標(biāo)卡尺為參照逐個(gè)測(cè)定菌球直徑，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.3 葡萄糖含量測(cè)定

利用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［11］測(cè)定發(fā)酵液中殘留的葡萄糖含量。

1.4.4 總油脂含量測(cè)定［12］

精確稱取干燥后的菌體0.5 g，置于研缽中充分研磨至粉狀，轉(zhuǎn)移到7 mL離心管中，加入3 mL CHCl3-CH3OH溶液（體積比1∶2），劇烈振蕩抽提1 min，再加入1 mL CHCl3溶液，再次劇烈振蕩 1 min，最后加入1 mL去離子水，振蕩萃取1 min，靜置30 min后溶液分層，將下層有機(jī)相全部取出至預(yù)先稱質(zhì)量的5 mL離心管中，水浴（80℃、4 h），將有機(jī)相蒸干，干燥后再次稱離心管質(zhì)量，減去空離心管的質(zhì)量即為總油脂的質(zhì)量。

1.4.5 ARA含量測(cè)定［13］

精確稱取1.4.4中總油脂0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液，60℃水浴加熱至油脂完全溶解，冷卻后加入2 mL體積分?jǐn)?shù)25%的BF3-C H3OH溶液，60℃水浴酯化20 min，再次冷卻后加入2 mL正己烷并振蕩混勻，最后加入2 mL NaCl飽和溶液并振蕩，靜置30 min后取上層有機(jī)相于1個(gè)干燥試管中，并加入少量無(wú)水Na2SO4以去除微量水分，供氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）分析使用。

GC/MS分析采用美國(guó)瓦里安公司氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀1200 L型GC-MS；色譜條件：色譜柱為DB-225，30 m×0.25 mm×0.15 μm毛細(xì)管柱；載氣為He；流量為1 mL/min，不分流進(jìn)樣；程序升溫條件：初始溫度180℃，維持2 min，以5℃/min速率升溫至230℃，維持12 min；質(zhì)譜條件：接口溫度250℃；離子源溫度200℃；離子化方式EI；電子能量70 eV；檢測(cè)電壓350 V；發(fā)射電流200 μA。

按照上述分析方法得到樣品氣相圖譜如圖1所示，其不同保留時(shí)間所對(duì)應(yīng)的油脂組分見(jiàn)表1。

圖1 M.alpina產(chǎn)油脂的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of lipids produced by M.Alpina

表1 M.alpina合成的油脂組分分析Table 1 Components of lipids produced by M.alpina

2 結(jié)果與討論

2.1 通氣量對(duì)M.alpina菌體生長(zhǎng)影響

氣升式反應(yīng)器中通氣量大小對(duì)絲狀真菌M.alpina菌體形態(tài)及生長(zhǎng)影響較大，通氣量較大時(shí)相應(yīng)的剪切力也會(huì)增加，可能影響菌體形態(tài)；通氣量較小時(shí)供氧不足，亦影響菌體生長(zhǎng)。為此，首先考察不同通氣量大小對(duì)M.alpina菌體形態(tài)及生長(zhǎng)的影響。

圖2 通氣量對(duì)M.alpina菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of aeration ratio on cell growth of M.alpina

在不同通氣量（0.6、1.0、1.4和1.8 vvm）時(shí)30 L氣升式反應(yīng)器恒速補(bǔ)料分批發(fā)酵，結(jié)果如圖2、圖3和表2所示。從圖2可以看出：發(fā)酵起始后菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72 h后菌體生長(zhǎng)放緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。結(jié)合圖3和表2可以看出：不同通氣量對(duì)發(fā)酵過(guò)程菌體形態(tài)有顯著影響，通氣量較低時(shí)（0.6 vvm），發(fā)酵液中菌球（圖3（e））平均直徑最大（3.9 mm），球狀菌體所占比例也最高（88.4%）；而隨著通氣量的增加，氣泡逸出液面的幾率增加，氣泡破碎產(chǎn)生的剪切力趨于明顯，發(fā)酵液中球狀菌體比例趨減，不規(guī)則羽狀形態(tài)菌體（圖3（f））比例不斷增加，同時(shí)菌球平均直徑減小，發(fā)酵液逐漸變得黏稠。比較不同通氣量水平可看出：通氣量1.0 vvm時(shí)，M.alpina生物量最高，此時(shí)羽狀菌體比例低于通氣量1.8 vvm時(shí)的比例，菌球（圖3（g））平均直徑相對(duì)于0.6 vvm通氣量時(shí)較?。?.4 mm），而菌體生物量和細(xì)胞得率系數(shù)均達(dá)到最大，分別為34.6 g/L和0.489 g/g，同時(shí)最大比生長(zhǎng)速率μmax（0.055 h-1）比其他通氣量時(shí)要高，且達(dá)到最大值的時(shí)間（12 h）要稍短?？梢?jiàn)，利用M.alpina進(jìn)行氣升式反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)ARA時(shí)，通氣量的選擇很關(guān)鍵。

在氣升式反應(yīng)器中，通氣量直接影響反應(yīng)器內(nèi)的體積傳氧系數(shù)kLa，進(jìn)而影響反應(yīng)器的傳氧速率。當(dāng)通氣量較低時(shí)（0.6 vvm），氣泡上升速率慢，剪切速率小，菌絲相互纏繞易形成大的菌球，菌球的形成有利于菌絲保持其完整形態(tài)而不發(fā)生斷裂，使菌體維持正常的生理狀態(tài)，但是Huang等［14］也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌球直徑過(guò)大時(shí)，不利于O2從發(fā)酵液中擴(kuò)散至菌球內(nèi)部，會(huì)導(dǎo)致菌球內(nèi)部的菌絲體因缺氧而死亡和自溶。而當(dāng)通氣量較大時(shí)（1.8 vvm），雖然溶氧能大幅提高，但隨著氣泡上升，速率加快，氣泡在液面破裂時(shí)，細(xì)胞所受的剪切力也快速增加，菌絲纏繞形成的菌球又會(huì)隨氣泡破裂而崩散，形成大量羽狀形態(tài)的菌體，導(dǎo)致發(fā)酵液變得黏稠，這亦會(huì)影響O2的傳遞［15］。而當(dāng)通氣量為1.0 vvm時(shí)，合適的通氣量有利于形成大小合適的菌球形態(tài)，維持較小的發(fā)酵液黏度，一方面有利于保持大部分菌絲以菌球形態(tài)相互纏繞而不斷裂，另一方面，較小的菌球也有利于O2的傳質(zhì)和生物量的積累，故通氣量1.0 vvm時(shí)較有利于M.alpina菌體的生長(zhǎng)。

圖3 通氣量對(duì)M.alpina菌體形態(tài)的影響Fig.3 Effects of aeration ratio on mycelia morphology of M.alpina

表2 通氣量對(duì)M.alpina菌體生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of aeration ratio on mycelia morphology by M.alpina

2.2 通氣量對(duì)M.alpina菌體中總油脂和ARA合成影響

ARA是M.alpina胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，其最終產(chǎn)量的決定性因素有生物量、總油脂含量和ARA占總油脂比例。圖4為通氣量對(duì)M.alpina菌體中總油脂和ARA生物合成的影響結(jié)果。

圖4 通氣量對(duì)M.alpina菌體中總油脂和ARA生物合成影響Fig.4 Effects of aeration ratio on total lipid and ARA biosynthesis by M.alpina

從圖4可以發(fā)現(xiàn)：總油脂的合成與菌體生長(zhǎng)呈部分耦聯(lián)關(guān)系，在0～72 h內(nèi)隨菌體生物量的快速增加而迅速積累，至96 h時(shí)，非油脂生物量基本達(dá)到穩(wěn)定，此后菌體主要進(jìn)行油脂的合成。從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程看，不同通氣量對(duì)菌體中總油脂的比例影響不大，最終總油脂產(chǎn)量主要依賴于菌體的生物量。同時(shí)由圖2和圖3可知，1.0 vvm通氣量時(shí)最有利于M.alpina菌體維持良好形態(tài)和生長(zhǎng)，發(fā)酵結(jié)束后生物量最高，所以此時(shí)總油脂含量也最高，達(dá)到15.2 g/L。但對(duì)比不同時(shí)期、不同通氣量條件時(shí)的ARA合成情況卻發(fā)現(xiàn)，在0～72 h階段，1.0 vvm通氣量時(shí)ARA平均合成速率最高（0.031 g/（L·h）），而在72～168 h階段，通氣量為1.4 vvm時(shí)，ARA平均合成速率最高（0.016 g/（L·h））。此外，分析總油脂中ARA比例變化規(guī)律同樣可以看出，發(fā)酵72 h后，通氣量1.4 vvm條件下，總油脂中ARA比例已明顯高于其他通氣量時(shí)比例。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，1.4 vvm通氣量對(duì)應(yīng)總油脂中ARA比例和ARA產(chǎn)量最高，分別為29.1%和3.93 g/L，比1.0 vvm通氣量時(shí)分別提高了31.6%和16.6%。以上分析表明：總油脂產(chǎn)量主要依賴于菌體生物量，當(dāng)通氣量1.0 vvm時(shí)最有利于菌體生長(zhǎng)，此時(shí)油脂也含量最高。

表3為不同菌體形態(tài)M.alpina中總油脂和ARA的含量比較結(jié)果。從表3可以看出，不同菌體形態(tài)中總油脂含量存在很大差異，其中羽狀菌體中油脂含量較低。分析原因可能是：通氣量較大時(shí)，菌絲發(fā)生斷裂，損傷較大，而這種損傷有時(shí)候是不可恢復(fù)的［16］，同時(shí)，損傷的菌體需要利用更多的底物進(jìn)行自身修復(fù)［17］，從而影響了油脂合成。因此，適當(dāng)提高通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后（72～168 h）ARA合成更有利，即溶氧在ARA合成中起著至關(guān)重要作用，這與Higashiyama等［18］發(fā)現(xiàn)溶氧可以提高產(chǎn)油微生物菌體胞內(nèi)不飽和脂肪酸比例結(jié)果一致，其原因是不飽和脂肪酸的形成要經(jīng)過(guò)脂肪酸鏈的延長(zhǎng)和油脂脫飽和作用，而O2是脫飽和途徑電子傳遞鏈的末端受體，并且O2還可調(diào)控脫飽和酶的形成。但結(jié)合圖2和圖3結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，M.alpina菌體生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物ARA合成的最適通氣量大小不一致，因此，采用分階段溶氧調(diào)控策略進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表3 不同菌體形態(tài)M.alpina中總油脂和ARA的含量比較Table 3 Comparison of total lipid and ARA productions in different mycelia morphology of M.alpina

2.3 兩階段通氣量控制策略對(duì) M.alpina生產(chǎn)ARA的影響

為了最大程度同時(shí)滿足M.alpina菌體生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物ARA合成需要，提高最終ARA產(chǎn)量，對(duì)發(fā)酵過(guò)程通氣量進(jìn)行了分階段控制，即初始階段（0～72 h）保持通氣量1.0 vvm，對(duì)數(shù)期后 （72～168 h）保持通氣量1.4 vvm，以1.0 vvm通氣量為對(duì)照，結(jié)果如圖5、圖6和表4所示。在0～72 h階段，M.alpina菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)通氣量對(duì)應(yīng)的剪切速率較小，有助于維持菌體成球狀（圖6），保證了氧傳遞效率，最終菌體能夠更快生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)總油脂和ARA合成速率的提高。在72～168 h階段，菌體生長(zhǎng)變緩，非油脂生物量基本維持穩(wěn)定，此后菌體生物量的增加主要來(lái)自油脂的合成，發(fā)酵結(jié)束時(shí)最終生物量為35.2 g/L，總油脂達(dá)到16.2 g/L，相比單一采用1.4和1.0 vvm通氣量進(jìn)行發(fā)酵均有了顯著提高。同時(shí)，在72～168 h階段因通氣量由1.0 vvm提升至1.4 vvm，導(dǎo)致剪切速率相應(yīng)增加，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌球平均直徑不斷減小，并且羽狀形態(tài)菌體比例有了一定增加（圖6），但與圖3（c）和圖3（d）相比，菌體形態(tài)有了明顯改善，發(fā)酵結(jié)束時(shí)羽狀菌體比例降低。另一方面，溶氧的提高增強(qiáng)了菌體油脂中非飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化能力，特別是ARA的合成，最終 ARA產(chǎn)量達(dá)到4.72 g/L，比對(duì)照（1.0 vvm）提高了40.1%?？梢?jiàn)，通過(guò)兩階段通氣量調(diào)控策略，在保證M.alpina良好生長(zhǎng)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)ARA產(chǎn)量的顯著增加。

圖5 兩階段通氣量調(diào)控策略對(duì)M.alpina生產(chǎn)ARA影響Fig.5 Effects of two-stage aeration ratio control strategy on ARA biosynthesis by M.apine

圖6 兩階段通氣量調(diào)控過(guò)程中M.alpina菌體形態(tài)變化Fig.6 The morphological changes of M.alpina in two-stage aeration ratio control strategy

表4 兩階段通氣量調(diào)控策略對(duì)M.alpina生產(chǎn)ARA的影響Table 4 Effects of two-stage aeration ratio control on ARA biosynthesis by M.alpina

3 結(jié)論

在30 L氣升式反應(yīng)器水平上研究了不同通氣量對(duì)M.alpina菌體生長(zhǎng)和ARA合成影響。結(jié)果表明，通氣量為1.0 vvm時(shí)有助于M.alpina菌體生長(zhǎng)，通氣量為1.4 vvm時(shí)有助于發(fā)酵對(duì)數(shù)期后（72～168 h）目標(biāo)產(chǎn)物ARA的合成。通過(guò)兩階段通氣量調(diào)控策略，最終ARA產(chǎn)量達(dá)到4.72 g/L，相比對(duì)照提高了40.1%，效果顯著，體現(xiàn)了氣升式反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)ARA過(guò)程中通氣量調(diào)控的重要性，同時(shí)為ARA的生產(chǎn)工藝研究提供了一種新的思路。

［1］Gill I，Valivety R.Polyunsaturated fatty acids：part 1.occurrence，biological activities and applications［J］.Trends Biotechnol，1997，15（10）：401-409.

［2］Horrobin D F，Huang Y S.The role of linoleic acid and its metabolites in the loweringofplasmacholesteroland the prevention of cardiovascular disease［J］.Int J Cardiol，1987，17（3）：241-255.

［3］Hoffman D R，Boettcher J A，Diersen-Schade D A.Toward optimizing vision and cognition in term infants by dietary docosahexaenoic and arachidonic acid supplementation：a review of randomized controlled trials［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2009，81（2）：151-158.

［4］鄧中濤，紀(jì)曉俊，聶志奎，等.高山被孢霉三階段培養(yǎng)法生產(chǎn)花生四烯酸油脂［J］.生物加工過(guò)程，2013，11（4）：8-13.

［5］Barclay W R.Method for production of archidonic acid：US，6541049［P］.2007-03-27.

［6］Kyle D J，Reeb S E，Sicotte V J.Infant formula and baby food containing docosahexaenoic acid obtained from dinoflagellates：US，5397591［P］.1995-03-14.

［7］叢蕾蕾，彭超，紀(jì)曉俊，等.高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸及其遺傳改造的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（9）：1232-1238.

［8］姚笛，于長(zhǎng)青，楊健，等.深黃被孢霉的飽和酶活性與花生四烯酸產(chǎn)量的關(guān)系［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工：學(xué)刊，2009（11）：24-29.

［9］Kahar P，Kobayashi K，Iwata T，et al.Production of ε-polylysine in an airlift bioreactor（ABR）［J］.J Biosci Bioeng，2002，93（3）：274-280.

［10］周正雄，盧英華，班甲，等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸油脂的研究進(jìn)展［J］.生物加工過(guò)程，2013，11（4）：72-78.

［11］Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959，31（3）：426-428.

［12］Bligh E G，Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction and purification［J］.Can J Biochem Physiol，1959，37（8）：911-917.

［13］董宏禎，許晨，許建中，等.微生物油脂中花生四烯酸的甲酯化工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32（24）：69-72.

［14］Huang M Y，Bungay H R.Microprobe measurements of oxygen concentrations in mycelial pellets［J］.Biotechnol Bioeng，1973，15（6）：1193-1197.

［15］Park E Y，Koizumi K，Higashiyama K.Analysis of morphological relationship between micro-and macromorphology of Mortierella species using a flow-through chamber coupled with image analysis［J］.J Eukaryot Microbiol，2006，53（3）：199-203.

［16］Higashiyama K，F(xiàn)ujikawa S，Park E Y，et al.Image analysis of morphological change during arachidonic acid production by Mortierella alpina1S-4［J］.J Biosci Bioeng，1999，87（4）：489-494.

［17］Shinmen Y，Shimizu S，Akimoto K，etal.Production of arachidonicacid byMortierella fungi［J］.ApplMicrobiol Biotechnol，1989，31（1）：11-16.

［18］Higashiyama K，Murakami K，Tsujimura H，et al.Effects of dissolved oxygen on the morphology of an arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4［J］.Biotechnol Bioeng，1999，63（4）：442-448.

（責(zé)任編輯 管 珺）

Effect of aeration ratio on production of arachidonic acid by Mortierella alpina in airlift reactor

WANG Cheng1，2，ZHENG Zhiyong1，2，ZHU Li3，GAO Minjie1，2，ZHAN Xiaobei1，2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

Mortierella alpina has strong ability to accumulate arachidonic acid（ARA）in the mycelium. When M.alpina fermentation was carried out in a 30 L airlift bioreactor，the aeration has significant impact on cell growth and ARA synthesis.Morphologcial analysis revealed that medium size pellet morphology was beneficial to the cell growth and ARA biosynthesis，while feathery mycelia morphology had negative effects on the production of total lipid and ARA.When the aeration was controlled at 1.0 vvm（gas volume flow per unit of liquid volume per minute）in the first stage，cells grew well and the morphology showed regular pellet mycelia.In the second stage，the aeration ratio was increased to 1.4 vvm for accumulation of ARA after logarithmic phase（72-168 h）.The two-stage aeration significantly improved mycelial morphology of M.alpina with the ARA yield of 4.72 g/L，which was 40.1%higher than the control.

Mortierella alpina；arachidonic acid；airlift bioreactor；aeration ratio

Q815

A

1672-3678（2015）01-0068-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.012

2014-01-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31171640）

王 成（1988—），男，江蘇宿遷人，研究方向：輕工技術(shù)與工程；詹曉北（聯(lián)系人），教授，E-mail：xbzhan@yahoo.com