王海濤, 王昌祿, 李貞景, 陳勉華

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

可降解蓖麻餅粕的蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王海濤, 王昌祿*, 李貞景, 陳勉華

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

利用酪素平板透明圈法初篩和測(cè)蛋白酶活力復(fù)篩，從分離自蓖麻餅粕和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株中篩選出1株高產(chǎn)蛋白酶菌株P(guān)3-2，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，最適碳源為麥芽糖，最適氮源為蓖麻餅粕，Na+對(duì)產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用，培養(yǎng)基初始pH值為7.5時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，最適接種量為4%，培養(yǎng)到36 h和84 h時(shí)有兩個(gè)產(chǎn)酶高峰。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到較佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成：2.0%麥芽糖、1.0%蓖麻餅粕及1.0%NaCl。

蓖麻餅粕；蛋白酶；篩選；發(fā)酵

蓖麻餅粕是蓖麻籽榨油后的副產(chǎn)物，含有75%～78%的有機(jī)質(zhì)，粗蛋白含量在30%以上，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料和有機(jī)肥料［1］。處于生長(zhǎng)期的家畜，特別是乳豬幼豬，如以蓖麻餅粕為飼料，其中偏高的蛋白質(zhì)含量會(huì)造成幼豬消化不良，影響生長(zhǎng)［2］。蓖麻餅粕作為肥料直接施于農(nóng)田，其中的大分子蛋白質(zhì)不能直接被植物吸收利用，肥效緩慢，無法滿足作物生長(zhǎng)對(duì)氮肥的需求，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的熱量會(huì)造成作物燒根、燒種［3］。為提高蓖麻餅粕的使用價(jià)值，科研人員多集中于研究蓖麻餅粕的脫毒處理，少見從蓖麻餅粕中篩選產(chǎn)蛋白酶的微生物的研究報(bào)道。

蛋白酶是能催化肽鍵水解的一群酶類，可將蛋白質(zhì)分解為多肽和游離氨基酸［4-8］。蛋白酶既可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)［9］。微生物蛋白酶大約占全球總酶制劑銷量的40%［10］。隨著蛋白酶應(yīng)用的日趨廣泛和需求的日益增多，分離篩選能分泌具有良好酶學(xué)特性并適用大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶高產(chǎn)菌株，是廣大科研人員的研究目標(biāo)和任務(wù)。

為提高蓖麻餅粕的使用價(jià)值，可篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌株發(fā)酵蓖麻餅粕，將其中的蛋白質(zhì)分解為小分子的多肽和游離氨基酸，制成高質(zhì)量的生物飼料、生物肥料。本實(shí)驗(yàn)從蓖麻餅粕中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株P(guān)3-2系從蓖麻餅粕中分離出的具有蛋白酶活力的菌株；蓖麻餅粕，天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；麩皮，市售；干酪素購自上海紫一試劑廠；福林酚購自北京索萊寶科技有限公司；其他用作培養(yǎng)基配制試劑均分析純，購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g，自來水1 000 mL，pH值為7.2～7.4。

2）蛋白酶選擇性培基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，干酪素4 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL。

3）產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蓖麻餅粕1 g，麥芽糖2 g，NaCl 0.9 g，自來水100 mL。

各培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃，20 min。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-B11型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；CHB-213型生物顯微鏡，OLYPUS公司；SP-2102UV型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；CL-32L型全自動(dòng)智能高壓蒸汽滅菌器，日本ALP公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

將蓖麻餅粕稀釋液涂布于平板上，多次分離后得到單菌落，將單菌點(diǎn)接于蛋白酶選擇性培養(yǎng)基上，根據(jù)透明圈的有無及大小初篩菌株。將初篩出來的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力，選出酶活力最大的菌株作為產(chǎn)蛋白酶菌株。

1.4.2 蛋白酶活力測(cè)定方法

采用Folin酚法測(cè)蛋白酶活力［11］，1 mL發(fā)酵液加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酪蛋白液，pH值為7.0，40℃水浴10 min，再加0.4 mol/L的三氯乙酸2 mL，保溫20 min后離心取1 mL上清液，加1 mL Folin酚在5 mL 0.4 mol/L的NaCO3堿性條件下40℃水浴20 min，測(cè)660 nm下的吸光值，空白實(shí)驗(yàn)在加酪蛋白液之前先加三氯乙酸，使酶失活，再加酪蛋白液。

蛋白酶活力定義為1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位U。

1.4.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將篩選出來的菌株接種到50 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，32℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，測(cè)定粗酶液中蛋白酶活力。優(yōu)化碳源、氮源、金屬離子、pH值、接種量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組分。試驗(yàn)設(shè)麥芽糖（A）、餅粕（B）、Na+（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白列，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

2.1.1 蛋白酶菌株的初篩結(jié)果

將分離自蓖麻餅粕和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株點(diǎn)接于酪素平板上，以有無透明圈及透明圈大小作為初篩依據(jù)。結(jié)果如表2。

表1 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Orthogonal experiment factors and their levels for optimization of medium components

表2 產(chǎn)蛋白酶菌初篩結(jié)果Tab.2 Primary screening results of protease-producing strains

從表2可以看出，供試菌株雖然能夠利用蛋白質(zhì)，但產(chǎn)生的蛋白酶活力不同，在菌落周圍出現(xiàn)透明圈大小也不同。根據(jù)透明圈的大小，可以初步判斷菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。其中，菌株M和菌株B是實(shí)驗(yàn)室保存的米曲霉和白地霉，菌株P(guān)3-2是從蓖麻餅粕中分離出來的細(xì)菌。圖1是菌株P(guān)3-2在添加酪素的平板上生長(zhǎng)及產(chǎn)生透明圈的情況。

圖1 菌株P(guān)3-2在酪素平板上的透明圈Fig.1 Clearing zones of strain P3-2 on casein plates

2.1.2 蛋白酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

將初篩出來的3株菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩，用福林試劑法測(cè)定中性蛋白酶活力大小，比較酶活力大小，選出酶活力最大的菌株為目標(biāo)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

從表3可以看出，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，菌株P(guān)3-2的蛋白酶活性最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇其作為產(chǎn)蛋白酶的菌株。

表3 產(chǎn)蛋白酶菌復(fù)篩結(jié)果Tab.3 Re-screening results of protease-producing strains

2.2 產(chǎn)酶條件的研究

2.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖、蔗糖、蓖麻餅粕、麩皮、甘油、麥芽糖、乳糖、淀粉作為不同的碳源，32℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定其中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖2。

圖2 不同碳源對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on protease production of strain P3-2

從圖2可以看出，以麥芽糖作為培養(yǎng)基碳源時(shí)，酶活最高，其次是乳糖和甘油。易于被微生物利用的葡萄糖作為碳源時(shí)，酶活最低，說明葡萄糖作為碳源時(shí)對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用，可能是由于代謝產(chǎn)物的阻遏作用。蓖麻餅粕是一種成分復(fù)雜的有機(jī)物，其中能作為碳源的物質(zhì)主要是粗纖維，產(chǎn)酶量低說明以蓖麻餅粕作為培養(yǎng)基碳源不利于產(chǎn)酶。

2.2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸銨、蛋白胨、胰蛋白胨、蓖麻餅粕、酵母膏、牛肉膏、硝酸鈉作為培養(yǎng)基唯一氮源，以麥芽糖為碳源，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出，不同氮源對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響較大。其中，以蓖麻餅粕作為氮源時(shí)，蛋白酶活性最高，其次為牛肉膏、蛋白胨。胰蛋白胨和酵母膏用作氮源時(shí)，可能對(duì)產(chǎn)酶有阻遏作用，導(dǎo)致酶活偏低。無機(jī)氮源硫酸銨和硝酸鈉用作氮源時(shí)，菌株P(guān)3-2基本不產(chǎn)蛋白酶。已有很多以餅粕作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)多種酶的研究報(bào)道，如食品級(jí)的淀粉酶、纖維素酶、單寧酶、植酸酶等［12-16］。

圖3 不同氮源對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on protease production of strain P3-2

2.2.3 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加不同種類的金屬離子，以不添加任何金屬離子為空白對(duì)照，測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖4。

圖4 不同金屬離子對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different metal ions on protease production of strain P3-2

從圖4可以看出，金屬離子對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)蛋白酶有較大影響。與不添加任何金屬離子相比，添加Na+能促進(jìn)產(chǎn)酶，其他金屬離子均有一定的抑制作用，特別是Zn2+對(duì)產(chǎn)酶抑制作用最大。

2.2.4 Na+對(duì)產(chǎn)酶的影響

調(diào)整培養(yǎng)基中的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%，0.5%，0.9%，1.3%，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖5。

通常情況下，金屬離子在低濃度范圍內(nèi)對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，超過一定范圍就會(huì)抑制產(chǎn)酶，甚至對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用。從圖5可以看出，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%～0.9%時(shí)，隨著添加量的增加酶活也逐漸升高，并在0.9%時(shí)達(dá)到最高，添加1.3%時(shí)酶活降低。

2.2.5 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)至4.5， 5.5，6.5，7.5，8.5，搖床發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖6。

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on protease production of strain P3-2

圖6 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of initial pH value of medium on protease production of strain P3-2

從圖6可以看出，培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶有較大影響，在7.5時(shí)達(dá)到最大值，pH值低于4.5或高于8.5時(shí)，產(chǎn)酶水平都顯著降低。

2.2.6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種活化10 h的菌種P3-2菌懸液，分別以1%，2%，3%，4%，5%的接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，搖床發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖7。

從圖7可以看出，接種量為4%時(shí)酶活最高，接種量過高或過低都不利于產(chǎn)酶。接種量過低，菌體延滯期變長(zhǎng)，菌體量少，影響酶的合成；接種量過高，則會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗過快，在酶的合成過程中，營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)不足。

2.2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將活化后的菌株P(guān)3-2菌懸液接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，從第24小時(shí)開始，每隔12 h測(cè)定中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖8。

從圖8可以看出，菌株P(guān)3-2在36 h和84 h出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，但72 h前的產(chǎn)酶量都較低，84 h的產(chǎn)酶量最高。在發(fā)酵前60 h，菌株P(guān)3-2的產(chǎn)蛋白酶量較低，第84 h時(shí)產(chǎn)酶量最高，之后略有降低。

圖7 不同接種量對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of amounts of inoculum on protease production of strain P3-2

圖8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of culture time on protease production of strain P3-2

2.2.8 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表4。

表4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及其極差分析Tab.4 Orthogonal experiment results and range analysis for optimization of medium components

由表4可以看出，麥芽糖含量對(duì)菌株P(guān)3-2產(chǎn)蛋白酶影響最為顯著，其次為蓖麻餅粕含量、NaCl濃度。培養(yǎng)基成分為A2B1C3D3時(shí)，即2.0%麥芽糖、1.0%蓖麻餅粕、1.0%NaCl，蛋白酶活力最高。由于在正交試驗(yàn)表中沒有出現(xiàn)組合A2B1C3D3，試驗(yàn)組4與組合A2B1C3D3接近且蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果也是最高。因此，選取實(shí)驗(yàn)組4和優(yōu)化后的組合A2B1C3D3進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組4蛋白酶活力為42.91 U/mL，組合A2B1C3D3活力為43.42 U/mL，即優(yōu)化后的組合蛋白酶活力略高于正交試驗(yàn)中出現(xiàn)的最佳組合。由此，確定培養(yǎng)基成分的最佳組合為A2B1C3D3，即2.0%麥芽糖、1.0%蓖麻餅粕、1.0% NaCl。

3 結(jié) 論

本研究采用酪素平板透明圈法從分離自蓖麻餅粕和實(shí)驗(yàn)室保存的菌株中進(jìn)行初篩，得到3株能夠產(chǎn)生明顯透明圈的菌株。利用Folin酚法測(cè)定3株菌的中性蛋白酶活力，得到1株分離自蓖麻餅粕的菌株P(guān)3-2，其蛋白酶活力最高。通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了影響菌株P(guān)3-2產(chǎn)酶的主要條件，確定麥芽糖為最適碳源，蓖麻餅粕為最適氮源，Na+促進(jìn)產(chǎn)酶，培養(yǎng)基較佳起始pH值為7.5，較佳接種量是4%，較佳培養(yǎng)時(shí)間為84 h。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為：麥芽糖含量2.0%、蓖麻餅粕含量1.0%、NaCl含量1.0%。通常情況下，培養(yǎng)條件對(duì)菌株的產(chǎn)酶水平影響較大，在合適的條件下發(fā)酵能促進(jìn)菌株的產(chǎn)酶。菌株P(guān)3-2來源于蓖麻餅粕，對(duì)其進(jìn)行誘變處理有望進(jìn)一步提高蛋白酶活力，為蓖麻餅粕的飼料化、肥料化利用奠定基礎(chǔ)。

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Screening of Protease-Producing Bacterium for Degrading Castor Bean Meal and Optimization of Its Fermentation Conditions

WANG Haitao， WANG Changlu*， LI Zhenjing， CHEN Mianhua
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A strain named P3-2 with the ability to produce protease was isolated from castor bean meal and laboratory preservation by the casein plate culture method and enzyme activity detection.The optimal fermentation conditions were investigated.The optimum carbon and nitrate sources were maltose and castor bean meal.Meanwhile，the yield of protease was increased by adding Na+and one peak of the protease yield was obtained when the initial pH value of medium was 7.5.Moreover，the optimum amount of inoculum was 4%and there were two peaks of the protease yield when culture time was 36 h and 84 h. Through the orthogonal experiment，the optimum compositions of medium were as follows：2.0%maltose，1.0%castor bean meal，and 1.0%NaCl.

castor bean meal；protease；screening；fermentation

葉紅波）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.01.008

2095-6002（2015）01-0043-06

王海濤，王昌祿，李貞景，等.可降解蓖麻餅粕的蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（1）：43-48.

WANG Haitao，WANG Changlu，LI Zhenjing，et al.Screening of protease-producing bacterium for degrading castor bean meal and optimization of its fermentation conditions［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（1）：43-48.

2014-01-17

王海濤，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)；

*王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。

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