楊博涵　朱旭江

【摘要】目的：建立仁青芒覺膠囊中西紅花的含量測定方法。方法：采用HPLC法，用光電二極管陣列檢測器（DAD），流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50），流速1.0ml/min，檢測波長440nm，柱溫25℃，對(duì)西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ進(jìn)行定量測定。結(jié)果：西紅花苷-Ⅰ在0.0336～0.4987μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，加樣回收率為97.43%，RSD=2.18%；西紅花苷-Ⅱ在0.0129～0.1818μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9998，加樣回收率為99.75%，RSD=1.53%結(jié)論：該方法操作簡便、專屬性、重現(xiàn)性好，可有效地控制仁青芒覺膠囊的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】仁青芒覺膠囊；HPLC；西紅花苷-Ⅰ；西紅花苷-Ⅱ

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）20-0016-03

HPLCdeterminationofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡinRenqingMangjuecapsules

YANGBohan1ZHUXujiang*

1.TianjinInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences，Tianjin300020，China；2.GansuInstituteforDrugControl，Lanzhou730070，China

Abstract：ObjectiveTosetupthequalitystandardofRenqingMangjuecapsules.MethodsThecontentofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡweredeterminedbyHPLC，whichconductedwithaDADdetectorandthedetectionwavelengthsetat440nm.ThecolumnwasC18（4.6mm×250mm，5μm）withmobilephaseconsistedofmethanol-water（50：55）andtheflowratewas1.0ml·min-1.Thecolumntemperaturemaintainedat25℃.ResultsHPLCdeterminedthatcrocin-Ⅰwasinrangefrom0.0336to0.4987μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9999）.Theaveragerecoverywas97.43%，RSDwas2.18%.HPLCdeterminedthatcrocin-Ⅱwasinrangefrom0.0129to0.1818μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9998）.Theaveragerecoverywas99.75%，RSDwas1.53%.ConclusionThemethodissimpleinoperation.Theresultsareaccurate，reliableandgoodinreproducibility.ThemethodcaneffectivelycontrolthequalityofRenqingMangjuecapsules.

Keywords：RenqingMangjuecapsules；HPLC；crocin-Ⅰ；crocin-Ⅱ

仁青芒覺始載于《盤德瓊乃》，是藏族驗(yàn)方。仁青芒覺膠囊由毛訶子、蒲桃、西紅花、木香、丁香、朱砂、馬錢子等藥材組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒，益肝養(yǎng)胃，明目醒神，愈瘡，滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（YBZ07062005-2010Z），含量測定項(xiàng)為檢查沒食子酸的含量，但處方中多味藥材含有沒食子酸，故該法的專屬性不強(qiáng)。仁青芒覺膠囊處方組成比較復(fù)雜，含量測定存在一定難度，導(dǎo)致該藥含量測定研究報(bào)道較少[1-3]。處方中的西紅花為鳶尾科植物番紅花（CrocussativusL.）的干燥柱頭，系貴重藥材，具有活血化瘀，清熱解毒，解郁安神的作用，且仁青芒覺膠囊為保密處方，處方量不明確。為了保證用藥的有效性，試驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了仁青芒覺膠囊中西紅花苷-I和西紅花苷-Ⅱ的含量測定方法，該法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的控制。

1儀器與試藥

1.1儀器Waterse2695高效液相色譜儀（Waters2998DAD檢測器，Empower色譜工作站，美國Waters公司）；MettlerAE240電子天平（瑞士梅特勒）；SartoriusR200D電子天平（德國賽多利斯公司）；KH-500DE超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；HGC-24A氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2試藥西紅花苷-I（批號(hào)：111588-200501）和西紅花苷-Ⅱ（批號(hào)：110589-201304，含量92.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；仁青芒覺膠囊（批號(hào)：100501、120001、130101）由甘肅省某藏藥企業(yè)提供。甲醇（色譜純，德國默克Merck公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法

2.1色譜條件色譜柱：資生堂CAPCELLPAKC18（4.6mm×250mm，5μm），WatersSymmetryC18（4.6mm×250mm，5μm），ThermoscientificBDSHYPERSILC18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50：50）；流速：1ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：440nm。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品8.28mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，作為西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?.20mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，作為西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液。分別精密吸取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液2ml至50ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置50ml棕色量瓶中，加稀乙醇適量，置冰浴中超聲處理（功率200W，頻率60KHz）30min，放至室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品的制備按照供試品溶液的制備方法，分別制備缺西紅花的陰性供試品溶液。

2.2.4樣品的測定按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5～10μl，注入液相色譜儀，測得液相色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ色譜分離良好，且陰性對(duì)測定結(jié)果無干擾。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系的考察取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣2、4、8、10、14、18、22、26、30μl，測定西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的峰面積，以進(jìn)樣對(duì)照品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的線性回歸方程

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的RSD分別為0.5%和0.4%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：130001）分別在0、2、4、6、8、24h，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件各進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的RSD分別為1.4和1.3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批供試品（批號(hào)：130001）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，“2.1”項(xiàng)的色譜條件測定含量。結(jié)果西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的RSD分別為0.98%和1.02%。

2.3.5加樣回收率精密量取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.1656mg/ml）1.5、2.0、2.5ml各3份和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液（0.06061mg/ml）0.8、1.0、1.2ml各3份，置50ml棕色量瓶中，溶劑采用氮吹儀吹干，再分別精密稱取已知含量同一批號(hào)（批號(hào)：130001，西紅花苷-Ⅰ含量1.2605mg/g；西紅花苷-Ⅱ含量0.4376mg/g）的供試品9份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的回收率。結(jié)果見表2、表3。

表2西紅花苷-Ⅰ加樣回收率

表3西紅花苷-Ⅱ加樣回收率

序號(hào) 樣品量

/g 西紅花苷-Ⅱ原有量

/mg 西紅花苷-Ⅱ加入量

/mg 測得總量

/mg 回收率

/% 平均回收率

/% RSD/%

99.751.53

2.4樣品測定結(jié)果按供試品溶液的制備方法和測定方法，對(duì)樣品進(jìn)行制備和測定，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量，測定3批供試品的含量，結(jié)果見表4。

表4仁青芒覺膠囊含量測定結(jié)果

3討論

3.1提取方法的選擇參考中國藥典[4]及有關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，提取溶劑選定為稀乙醇。西紅花苷文獻(xiàn)報(bào)道較多[7-8]，大多采用超聲提取方法。西紅花苷為水溶性類胡蘿卜素類成分，分子中具有多個(gè)共軛雙鍵，導(dǎo)致其穩(wěn)定性差，且對(duì)溫度非常敏感[9]。研究對(duì)供試品在冰浴中和常溫下超聲處理方法進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，冰浴比常溫提取所測得的西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ峰面積略高，故采用冰浴超聲提取作為仁青芒覺膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的提取方法。

3.2超聲時(shí)間的選擇根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，供試品制備采用冰浴中分別超聲（功率200W，頻率60KHz）20、25、30、40、50min，依法測定峰面積，結(jié)果表明，超聲提取30min時(shí)的測定值略高，故選擇提取時(shí)間為30min。

3.3測定波長的選擇對(duì)西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果在440nm波長處有最大吸收，故選擇440nm作為測定波長。

3.4方法適用性試驗(yàn)取同一批樣品按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，分別采用三種品牌的色譜柱測定，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ測得含量的RSD分別為1.92%和1.56%，結(jié)果無明顯差別，說明該方法適用性較好。

3.5小結(jié)樣品各批次間西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量差異較大，說明現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能控制產(chǎn)品質(zhì)量，使各批樣品的投料量存在差異。實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定仁青芒覺膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量，此法方便可靠、重現(xiàn)性好，為仁青芒覺膠囊的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了參考資料。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2015.07.10）