李春英，夏依拉·艾尼，+，毛建衛(wèi)，龔金炎（.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)與食品科學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與營養(yǎng)系，浙江杭州30058；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江杭州30023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)會創(chuàng)新中心，浙江杭州30023）

梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

李春英1，夏依拉·艾尼1，+，毛建衛(wèi)2，3，龔金炎2，3
（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)與食品科學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與營養(yǎng)系，浙江杭州310058；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)會創(chuàng)新中心，浙江杭州310023）

梔子黃是傳統(tǒng)中藥梔子的主要開發(fā)產(chǎn)品，在食品、藥品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文通過單因素實驗對底物濃度、酶量和反應(yīng)時間等進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，研究了梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制效果及酶抑制動力學(xué)。結(jié)果表明：體外研究α-葡萄糖苷酶抑制活性的最佳反應(yīng)體系為底物濃度為3 mmol/L、酶量為50 μL、反應(yīng)時間為50 min；梔子黃對嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現(xiàn)出抑制活性，而對豬胰腸來源的α－葡萄糖苷酶、大米α－葡萄糖苷酶和酵母α－葡萄糖苷酶表現(xiàn)出不同的抑制活性，且抑制類型為競爭性抑制。因此，梔子黃具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究對提升降糖效果和解析降糖機(jī)制的相關(guān)研究方面具有重要的參考價值。

梔子黃，抑制動力學(xué)，α-葡萄糖苷酶

中藥梔子（Gardenia jasminoides Ellis）屬于茜草科（Ruacbieae）梔子屬植物。我國產(chǎn)5種，在河南、江浙、江西、湖南等地都有分布［1］。梔子黃是梔子的主要活性成分［2］，具有清熱祛火，涼血利膽，降低膽固醇的作用。梔子黃因為安全性高，在美國、英國、加拿大等國很暢銷，特別在日本對梔子黃色素年需量則達(dá)到320 t［3］。

我國梔子資源豐富，近年來對梔子的研究方興未艾，但對梔子黃的精制、功能特性研究較少，且研究多集中在梔子黃的抗氧化功能上［4］。已有文獻(xiàn)報道，梔子黃可以降低血清總固醇、甘油三酸酯、低密度脂蛋白水平［5］。梔子及其有效部位能降低類固醇誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖［6］?？蓪λ难踵奏ふT導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖有降低作用［7］。但關(guān)于梔子及其活性成分對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的文獻(xiàn)很少。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類和梔子黃對α-葡萄糖苷酶的活性均有顯著的抑制作用［8］。

α-糖苷酶抑制劑可以延緩碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖峰值和降低血糖波動以及糖化血紅蛋白含量。α-葡萄糖苷酶來源廣泛，有動物源、植物源以及微生物源。目前，市場上所售的α-葡萄糖苷酶來源及價格均不同，而大部分的α-葡萄糖苷酶研究者研究及開發(fā)α-葡萄糖苷酶抑制劑時使用酵母源或細(xì)菌源α-葡萄糖苷酶。本文為了研究梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性，利用α-葡萄糖苷酶，首先建立體外測定抑制α-葡萄糖苷酶活性的最優(yōu)反應(yīng)體系，其次研究梔子黃的α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)特性，最后探討其不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制特性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

梔子、梔子黃粉末杭州畢爾銳思生物技術(shù)有限公司提供；對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pnitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、不同來源α-葡萄糖苷酶Sigma公司；豬胰腸α-葡萄糖苷酶自制；其他試劑均為分析純。

電子精密天平OHAUS公司；基礎(chǔ)酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher公司；磁力攪拌器德國IKA公司；恒溫電熱水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TDL-5離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱上海愛郎儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1pNPG法測定α-葡萄糖苷酶活力反應(yīng)流程將梔子黃（或空白組為磷酸緩沖液KPB） 用KPB（100 mmol/L，pH7.0）稀釋成相應(yīng)的濃度→置于96孔板中→加一定量0.075 U α-葡萄糖苷酶→加50 μL一定濃度底物pNPG→在37℃條件下反應(yīng)30 min→加入Na2CO（3100 mmol/L）終止反應(yīng)→37℃條件下反應(yīng)10 min后，在405 nm的波長下用酶標(biāo)儀測定吸光值。

1.2.2最佳反應(yīng)體系的建立傳統(tǒng)的α-葡萄糖苷酶法如Pierre等［9］的方法，以pNPG為底物，Na2CO3溶液作為終止液，在37℃，pH為6.8左右時測定α-葡萄糖苷酶活性。所以本實驗考察底物pNPG濃度（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L）、酶用量（20、30、40、50、60、70 μL）和反應(yīng)時間（10、20、30、40、50、60、70 min）等因素對梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響。當(dāng)?shù)孜餄舛雀淖儠r酶用量（50 μL）和反應(yīng)時間（30 min）不改變、當(dāng)酶用量改變時底物濃度（3 mmol/L）和反應(yīng)時間（30 min）不改變、當(dāng)反應(yīng)時間改變時底物濃度（3 mmol/L）酶用量（50 μL）不改變。具體操作按照1.2.1給出的實驗流程進(jìn)行。

1.2.3梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果不同濃度梔子粉末（0.05、0.125、0.25、1、2、3 mg/mL）和不同濃度梔子黃粉末（0.00625、0.025、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL），利用以上述建立的最優(yōu)反應(yīng)體系測定其對α-葡萄糖苷酶抑制活性并計算IC50值。同時設(shè)定相同體系下的樣品背景對照組，以阿卡波糖為陽性對照。α-葡萄糖苷酶抑制活性按下列公式計算：

1.2.4梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制動力學(xué)實驗根據(jù)梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制確定動力學(xué)實驗所用抑制劑濃度。加入不同濃度的底物pNPG（0.75、1.5、3、6、12、24 mmol/L），按上述方法測定不添加抑制劑和添加不同濃度抑制劑時，不同濃度底物下的反應(yīng)速度。按Lineweave-Burk法作圖，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，繪制梔子黃的抑制作用動力學(xué)曲線，確定抑制類型。

1.2.5梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性根據(jù)1.2.3確定的梔子黃濃度以按上述建立的最優(yōu)反應(yīng)體系測定梔子黃對豬胰腸、大米、酵母、嗜熱芽孢桿菌來源的α－葡萄糖苷酶抑制活性。以阿卡波糖為陽性對照，其結(jié)果IC50（半抑制率濃度）來表示。

1.2.6統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（Mean±SD，n=3），并采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析.

2　結(jié)果與分析

2.1反應(yīng)體系的確定

在藥物篩選過程中，傳統(tǒng)檢測α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的方法為分光光度法。底物濃度、pH、酶量、反應(yīng)時間等因素都對酶活力有影響，而且不同來源的酶，其活力、性質(zhì)等存在差異，所以在測定酶抑制活性時，建立完善的反應(yīng)體系，以獲得準(zhǔn)確可信的酶活性測定數(shù)據(jù)是十分重要的。所以本實驗優(yōu)化底物濃度、酶量和反應(yīng)時間建立最優(yōu)反應(yīng)體系。

圖1　底物濃度對反應(yīng)體系的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on reaction system

2.1.1底物濃度的選擇由圖1可見，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^3 mmol/L時，吸光度增加值趨于平緩，說明此時酶活力基本保持不變，酶和底物有最佳的配比，故酶反應(yīng)的最適底物濃度為3 mmol/L。

2.1.2最適酶量的選擇由圖2可見，當(dāng)酶量超過50 μL時，吸光度不再隨酶量的增加而增加，并且隨著酶量的繼續(xù)增加反而出現(xiàn)了下降趨勢，說明此時底物已經(jīng)消耗完全，再增加酶量，會出現(xiàn)酶過量，則可能不能正常反應(yīng)抑制活性，故最適酶量為50 μL。

圖2　酶體積對反應(yīng)體系的影響Fig.2　Effect of amount of enzyme on the reaction system

圖3　反應(yīng)時間對反應(yīng)體系的影響Fig.3　Effect of reaction time on the reaction system

2.1.3反應(yīng)時間的確定由圖3可見，隨著時間的增加吸光值也隨增大，在50 min時進(jìn)入到平穩(wěn)期，說明此時酶與底物已完全反應(yīng)，在增長時間則可能會影響正常反應(yīng)抑制活性，所以最佳作用時間為50 min。所以得出的最佳反應(yīng)體系為：底物PNPG濃度3 mmoL/L，酶用量50 μL，反應(yīng)時間50 min。

2.2梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性抑制動力學(xué)實驗

研究不同濃度梔子提取物與梔子黃對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果，結(jié)果表明梔子提取物和梔子黃對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，其抑制效果隨濃度增大而增加。相同濃度下，梔子黃的抑制效果顯著高于梔子提取物（見圖4）。

圖4　梔子提取物和梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制作用曲線Fig.4　The inhibitory effect of Gardenia jasminoides extracts and Gardenia Yellow on α-glucosidase

圖5　梔子黃雙倒數(shù)抑制曲線Fig.5　Lineweaver-Burk curves of Gardenia Yellow

基于Lineweaver-Burk的方法，構(gòu)建梔子黃的酶抑制動力學(xué)曲線。由圖5可知，三條直線在誤差允許范圍內(nèi)交于Y軸正半軸，添加梔子黃后，可以看出反應(yīng)速率相對無抑制劑組來說明顯下降，隨抑制劑濃度的增大，反應(yīng)速率降低但反應(yīng)速度Vmax保持不變，米氏常數(shù)Km隨抑制劑濃度增加而變大?？梢耘卸d子黃對α-葡萄糖苷酶屬于典型的競爭性抑制類型。

梔子黃抑制類型為競爭性抑制，說明抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競爭酶的活性中心，并于酶形成可逆的酶抑制劑復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合。從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶促反應(yīng)速度下降，使酶的催化活性降低，這為我們研究梔子黃的降血糖作用機(jī)制提供了實驗依據(jù)。

2.3梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性

梔子黃對不同來源α－葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果見表1。從表1可以看出，阿卡波糖對豬胰腸α-葡萄糖苷酶和大米來源α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出抑制活性，對酵母與嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷沒有表現(xiàn)出抑制活性。梔子黃對豬胰腸α-葡萄糖苷酶、大米來源的α-葡萄糖苷酶、嗜酵母來源的α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出抑制效果。IC50分別為669.7、184.3、135.2 μg/mL，對嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現(xiàn)出抑制活性。

表1　梔子黃對不同來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1　Inhibitory effect of Gardenia Yellow against α-glucosidase from various origins

梔子黃能有效抑制體外α-葡萄糖苷酶活性，這可能是其有效控制血糖的原因。由于體外酶和體內(nèi)酶有一定差異性，還需進(jìn)一步驗證體內(nèi)抑制作用，通過體內(nèi)模型研究梔子黃對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，并研究其發(fā)揮作用的有效劑量，為體內(nèi)降血糖機(jī)制提供理論依據(jù)；梔子黃α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)對于靶酶的來源表現(xiàn)出不同的活性，說明每種α-葡萄糖苷酶抑制成分針對靶酶的來源具有一定的選擇性。

3　結(jié)論

梔子黃能有效抑制體外α-葡萄糖苷酶活性，這可能是其有效控制血糖，尤其是餐后血糖的原因。作為安全性高的中藥材梔子的重要活性成分梔子黃在最佳反應(yīng)體系為底物濃度為3 mmol/L、酶量為50 μL、反應(yīng)時間為50 min時具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制活性為競爭性抑制。其嗜熱芽孢桿菌來源的α-葡萄糖苷酶沒有表現(xiàn)出抑制活性，而對豬胰腸來源的α-葡萄糖苷酶、大米來源α-葡萄糖苷酶和酵母來源α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出抑制活性。這為今后開展梔子降血糖活性的研究，開發(fā)無毒無副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的意義。

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Study on the inhibitory effect of Gardenia Yellow on α-glucosidase activity

LI Chun-ying1，SHAHIRA·Hani1，+，MAO Jian-wei2，3，GONG Jin-yan2，3
（1.Department of Food Science and Natrition School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Zhejiang University of Science and Technology School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，China）

Gardenia Yellow is the prime developed product of the traditional Chinese medicine Gardenia，are widely used in food，pharmaceutical and other fields.In this paper，an optimum system was established to study the alpha-glucosidase inhibitory activity through the single factor on substrate concentration，the amount of enzymes and reaction time.On that basis，the effect of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase inhibitory and kinetics of enzyme inhibition were studied.The results showed that the best reaction system of alpha-glucosidase inhibitory activity was as follows：substrate concentration was 3 mmol/L，amount of enzyme was 50 μL and reaction time was 50 min，inhibition level was more significant for the alpha-glucosidase systems originate from pig pancreas and intestinerice，and Saccharomyces cerevisiae，but not for the Bacillus subtilis.Inhibitory characters of Gardenia Yellow on alpha-glucosidase belongs to a competitive inhibition system.Research on hypoglycemic component from Gardenia Yellow and studying the mechanisms had significant practical value and also could broad the application prospects，then of course will lay a solid theoretical basis for the future search of traditional Chinese medicine on treating diabetes.

Gardenia Yellow；inhibitory kinetics；Alpha-glucosidase

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.015

2015－03－31+：并列第一作者

李春英（1971-），女，副教授，主要從事天然產(chǎn)物生理活性方面的研究，E-mail：cyli@zju.edu.cn。夏依拉·艾尼（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物生理活性方面的研究，E-mail：xayiral9@126.com。

國家十二五科技支撐計劃資助項目（2011BAD23B02）。