任文潔，黃志兵，許　楊，李燕萍，涂　追，蘇保偉，季艷偉（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合院，江西南昌330047）

伏馬菌素B1膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制

任文潔，黃志兵*，許楊，李燕萍，涂追，蘇保偉，季艷偉
（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合院，江西南昌330047）

目的：為制備一種快速檢測玉米中伏馬菌素B1（FB1）膠體金免疫層析試紙條。方法：采用碳化二亞胺法合成檢測抗原FB1-BSA，檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，辛酸-飽和硫酸銨法對抗FB1單克隆抗體腹水進(jìn)行純化，將金標(biāo)抗體噴于金標(biāo)墊，檢測抗原FB1-BSA（T線）和羊抗鼠二抗（C線）噴涂于硝酸纖維素膜（NC膜）。結(jié)果：得到的單克隆抗體效價為1.28×105。該試紙條的NC膜噴涂的檢測抗原濃度為200 μg/mL，羊抗鼠二抗?jié)舛葹?.0 mg/mL，噴涂量分別為0.74 μL/cm，試紙條靈敏度為20 ng/mL，檢測時間只需5 min，試紙條于4℃至少可保存12個月。結(jié)論：采用制備的試紙條對玉米實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與高效液相和酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果相一致，說明該試紙條適合現(xiàn)場快速檢測伏馬菌素B1。

快速檢測，膠體金免疫層析，伏馬菌素B1，玉米

真菌毒素污染一直是全球食品安全領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［1］。伏馬菌素（Fumonisins，F(xiàn)Bs）是一類主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性毒素，大多存在于玉米及其制品中。當(dāng)前有28種不同的伏馬菌素被報(bào)道，其中伏馬菌素B1是FBs中毒性最強(qiáng)的主要組分，占總量的70%～80%［2］。研究表明，F(xiàn)B1的主要毒性有神經(jīng)毒性、致癌性、致突變性等，能誘發(fā)人類多種疾?。?］，1993年國際癌癥研究中心（IARC）將FB1列為2B類致癌物質(zhì)［4］。瑞士制定了食品中伏馬菌素的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 mg/kg；2014年7月國際食品法典委員會（CAC）將玉米當(dāng)中伏馬菌素的限量定為4 mg/kg；我國尚未制定食品中伏馬菌素的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，F(xiàn)B1的檢測方法主要包括儀器檢測方法［5］和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法［6］，這些檢測方法不適合現(xiàn)場快速檢測。膠體金免疫層析法具有簡便、快速、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)［7-8］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域的現(xiàn)場快速檢測［9］。

目前，已有采用較多膠體金免疫層析試紙條快速檢測FB1的報(bào)道［10-15］，有的文獻(xiàn)雖然報(bào)道的檢測FB1試紙條的靈敏度為5 ng/mL，然而，當(dāng)FB1濃度達(dá)到20 ng/mL時，試紙條的檢測線（T線）的顏色尚未完全消失，且未對試紙條的各主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試紙條的穩(wěn)定性也未涉及［10］。本文旨在制備出快速檢測FB1的膠體金免疫層析試紙條，并對影響試紙條性能的各主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，對于食品中FB1污染的快速篩查和防控具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米樣品購自本地市場并保存于實(shí)驗(yàn)室；FB1等真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、檸檬酸三鈉、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDCA）美國Sigma公司；抗FB1單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)制備；甲醇（色譜純）、硫酸銨等分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜（Vivid 170，Sartorius CN140，Millipore135，Vivid 90，Sartorius CN 95，whatman prima 40，whatman AE99）和羊抗鼠IgG二抗上海杰一生物技術(shù)有限公司；PriboFast?FB1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒新加坡Pribolab公司。

Ultrospec-4300紫外可見光分光光度儀瑞典Pharmacia公司；Multiskan FC酶聯(lián)免疫檢測儀、Multfuge X1R低溫高速離心機(jī)美國Thermo公司；超純水制備儀美國Millipore公司；XYZ 3000平臺系統(tǒng)及試紙條切刀美國Biodot公司；H-600透射電鏡日本Hitachi公司；MA磁力攪拌加熱器德國Electromantle公司；Waters 510高效液相色譜儀和2475型熒光檢測器美國Waters公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1檢測抗原（FB1-BSA）的合成和單克隆抗體（McAb）純化采用碳化二亞胺法合成檢測抗原［16］。取1 mg FB1標(biāo)品和4 mg BSA分別溶于1 mL的1×PBS，兩者混勻后加入溶度為20 mg/mL新配制的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDCA）水溶液0.2 mL，在25℃的水平搖床上反應(yīng)2 h（反應(yīng)過程中補(bǔ)加0.2 mL 20 mg/mL的新配制的EDCA水溶液），靜置20 min后，在4℃冰箱中1×PBS（0.1mol/L磷酸鹽緩沖液）透析72 h，測其濃度，分裝于-20℃凍存。抗FB1單克隆抗體按照文獻(xiàn)［17］方法由本實(shí)驗(yàn)室制備，并采用辛酸-飽和硫酸銨法對單克隆抗體進(jìn)行純化［16］。經(jīng)超濾除去鹽離子后的檢測抗原（FB1-BSA），用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行分析，對其偶聯(lián)比進(jìn)行測定。采用間接酶聯(lián)免疫（ELISA）方法對單克隆抗體進(jìn)行評估，并確定最佳包被抗原濃度和抗體工作稀釋度。

1.2.2膠體金溶液和金標(biāo)抗體的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金［10］，并采用透射電鏡（TEM）測定膠體金顆粒大小及分散情況，同時計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑。采用pH梯度實(shí)驗(yàn)法確定最適pH和蛋白梯度實(shí)驗(yàn)法確定最適抗體量［18］，然后制備金標(biāo)抗體。磁力攪拌下，用1%碳酸鉀將膠體金溶液調(diào)整為最適pH，將用超純水稀釋100倍的FB1單克隆抗體逐滴加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌30 min。然后加入原體積10%的BSA（10%，w/v），繼續(xù)攪拌15 min。將已經(jīng)標(biāo)記好的膠體金10000 g、4℃離心30 min，吸取上清，將沉淀的金標(biāo)抗體用金子稀釋液（含10%蔗糖、1.0% BSA、0.1%PEG-2000、2.5%海藻糖及0.02%疊氮鈉的0.01 moL/L pH 7.4的PBS）復(fù)溶4℃保存。

1.2.3膠體金探針合成的最適pH和最適抗體量的確定采用pH梯度實(shí)驗(yàn)法。取8個5 mL的三角瓶，分別加入3 mL的膠體金溶液，依次加入10、12、14、16、18、20、24、28 μL的碳酸鉀溶液，每個瓶子加入2 μg的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記、離心。測膠體金探針制備所得的上清的OD值，與參比（只采用超純水將相同量的單克隆抗體稀釋相同倍數(shù)，該抗體未與膠體金標(biāo)記）相比較，得最適pH。采用蛋白梯度實(shí)驗(yàn)法。取8個5 mL的三角瓶，分別加入3 mL的膠體金溶液、20 μL的碳酸鉀溶液，依次加入0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 μg的單克隆抗體，進(jìn)行標(biāo)記、離心。測膠體金探針制備所得的上清的OD值，與參比（只采用超純水將相同量的單克隆抗體稀釋相同倍數(shù)，該抗體未與膠體金標(biāo)記）相比較，得最適抗體量。

1.2.4硝酸纖維素膜（NC膜）的選擇選擇Vivid 170，Sartorius CN140，Millipore135，Vivid 90，Sartorius CN 95，whatman prima 40，whatman AE99，共七種不同的NC膜。將各種NC膜分別組成試紙條，然后進(jìn)行空白樣品的測定，觀察各膜上檢測線及質(zhì)控線的顏色強(qiáng)度和溶液在NC膜上的遷移速度，最終確定最適NC膜。

1.2.5FB1-BSA與金標(biāo)抗體量的確定檢測線上FB1-BSA的量設(shè)定為200、300、400 μg/mL共3組，每組中膠體金墊上金標(biāo)抗體的量分別為10、12和14 μL/cm。根據(jù)檢測線的形態(tài)、檢測線顏色強(qiáng)度等確定最適的檢測抗原與金標(biāo)抗體的量。

1.2.6試紙條的組裝及檢測原理將濃度為200 μg/mL檢測抗原（T線）和濃度為1.0 mg/mL羊抗鼠二抗（C線）按照0.74 μL/cm的量噴涂于硝酸纖維素膜（NC膜）、噴有金標(biāo)抗體探針（14 μL/cm）的膠體金墊、樣品墊和吸水墊一次黏貼到PVC底板上，切成試紙條。

試紙條檢測原理概述為：當(dāng)樣品中FB1濃度小于1 mg/mL時，F(xiàn)B1先與金標(biāo)抗體結(jié)合，多余的金標(biāo)抗體也會與T線上的檢測抗原結(jié)合，故T線和C線均顯紅色，結(jié)果為陰性，采用“-”表示；當(dāng)樣品中FB1濃度大于等于1 mg/mL時，F(xiàn)B1先與金標(biāo)抗體完全結(jié)合，此時沒有剩余的金標(biāo)抗體，T線上的檢測抗原不能與金標(biāo)抗體結(jié)合，故T線不顯紅色，C線顯紅色，結(jié)果為陽性，采用“+”表示。

1.2.7試紙條的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性（n=3） FB1標(biāo)準(zhǔn)品用PBS梯度稀釋成0、5、10、20、30、50 ng/mL，取100 μL滴于樣品墊上，5 min左右觀察結(jié)果。使檢測線顏色完全消失的標(biāo)準(zhǔn)品濃度則可認(rèn)為是該試紙條使用時最容易、最準(zhǔn)確的判定濃度。將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素（OTA）和黃曲霉素B1（AFB1）四種真菌毒素分別配制為濃度為5、50 ng/mL，然后采用制備好地試紙條，分別測定上述兩個濃度下的各種真菌毒素的顯色情況，判斷試紙條的特異性。將組裝好的試紙條真空封裝，置于4℃保存，每隔3個月檢測一次，每組2條，分別為0、20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品濃度，判斷試紙條的穩(wěn)定性。

1.2.8三種方法檢測谷物中FB1的比較實(shí)驗(yàn)分別用高效液相色譜法、ELISA法和試紙條三種方法對玉米樣品中的伏馬菌素（B1）進(jìn)行測量，每個樣品測定3次，對其結(jié)果進(jìn)行比較。高效液相色譜法按文獻(xiàn)［16］進(jìn)行樣品處理和測定，取1 g的玉米樣品，加入5 mL甲醇-水（3∶1），振蕩15 min，4000 g離心10 min，取2.5 mL上清液過強(qiáng)陰離子交換柱（SAX-SPE柱）后，鄰苯二甲醛（OPA）衍生1 min，取20 μL進(jìn)樣測定；ELISA法按商品化的PriboFast?FB1ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，取20 g玉米樣品，加入100 mL 70%的甲醇，振蕩5 min，3000×g離心5 min，取上清液50 μL，加入700 μL樣品稀釋液稀釋，取100 μL上樣測定；試紙條的樣品處理和測定，取1 g的玉米樣品，加入5 mL 1×PBS，振蕩15 min，4000×g離心10 min，取上清液1 mL，稀釋10倍，取100 μL滴于樣品墊上進(jìn)行檢測。

圖1　FB1-BSA（A）和BSA（B）的MALDI-TOF-MS圖譜Fig.1　MALDI-TOF-MS spectrum of FB1-BSA（A）and BSA（B）

2　結(jié)果與分析

2.1純化后抗體效價的測定

伏馬菌素屬于半抗原物質(zhì)，F(xiàn)B1分子量約為721［17］，必須先將半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性。由圖1 MALDI-TOF-MS儀器分析圖可知，F(xiàn)B1-BSA的Mw為72845，BSA的Mw為67035，偶聯(lián)比約為（72845－67035）/721≈8。根據(jù)分子量的改變并結(jié)合紫外可見光譜掃描的方法確定FB1與BSA偶聯(lián)成功。腹水抗體中成分復(fù)雜，非特異性抗體的雜蛋白較多，其中的雜蛋白等成分可能會在檢測時影響單克隆抗體特異性、敏感度和生物活性，因此對腹水抗體進(jìn)行純化是必要的。使用EPOCH微孔板分光光度計(jì)直接測定抗體的蛋白濃度，純化后單抗蛋白含量為1.25 mg/mL。間接非競爭ELISA方法測定FB1抗體效價為1∶128000（見表1）。

表1　間接非競爭ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　The detection results of indirect ELISA

2.2膠體金溶液的制備及鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液如圖2（A）所示，所得膠體金溶液呈紅色，澄清均勻，4℃存放7個月無明顯變化，說明所得膠體金溶液比較穩(wěn)定；膠體金溶液的紫外掃描電鏡結(jié)果見圖2（B），顯示膠體金紫外最大吸收峰為525 nm，峰面積比較小，說明膠體金溶液的粒徑分布比較均勻；膠體金顆粒電鏡觀察結(jié)果見圖2（C），照片顯示膠體金顆粒分布比較均勻，無異形顆粒。統(tǒng)計(jì)圖片中膠體金顆粒的直徑，絕膠體金顆粒的粒徑在20～30 nm之間，平均粒徑約25 nm。

圖2　膠體金溶液的制備及鑒定Fig.2　Preparation and identification of gold colloid solution

2.3金標(biāo)探針的鑒定

標(biāo)記后的膠體金探針溶液如圖3（A）所示，其顏色為紅色，澄清透亮，其電鏡照片見圖3（B），可見其顆粒分布較均勻，顆粒周圍有明顯的蛋白暈環(huán)，說明標(biāo)記效果較好。

圖3　金標(biāo)探針的鑒定Fig.3　Identification of gold nanoparticle-McAb probe

2.4膠體金探針合成的最適pH

膠體金溶液的pH和單克隆抗體的投入量是制備膠體金探針的關(guān)鍵，它們不僅影響膠體金探針的穩(wěn)定性，對試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性也有很大的影響。圖4結(jié)果顯示，當(dāng)加入1%碳酸鉀的量在12.5～20 μL的范圍內(nèi)，上清中的抗體量比較少，表示標(biāo)記成功，測膠體金溶液的pH為6.5，且當(dāng)碳酸鉀的量為20 μL時，制備的膠體金探針更穩(wěn)定，故選擇加入1%碳酸鉀的量為20 μL。

圖4　膠體金探針合成的最適pHFig.4　Optimum pH of gold nanoparticle-McAb probe

2.5膠體金探針合成的最適抗體量

膠體金溶液的單克隆抗體的投入量也是制備膠體金探針的關(guān)鍵。圖5顯示，當(dāng)FB1單克隆的量大于1 μg時，上清中的抗體量趨于穩(wěn)定，為了保證探針的靈敏度，故選取1 μg為最低穩(wěn)定蛋白量，通常還要在最低穩(wěn)定蛋白量的基礎(chǔ)上再增加20%為制備膠體金探針的合適量［19］，因此選擇1.2 μg/mL為最適抗體量。

圖5　膠體金探針合成的最適抗體量的確定Fig.5　Optimum quantity of McAb of gold nanoparticle-McAb probe

2.6NC膜的選擇

檢測線（T）和控制線（C）均劃在NC膜上，免疫反應(yīng)在此反應(yīng)，因此NC膜也是試紙條表征的關(guān)鍵因素之一。圖6顯示了不同NC膜上檢測線和質(zhì)控線的情況，由圖6可知Sartorius CN 140和Sartorius CN 95膜上檢測線和質(zhì)控線的形態(tài)和顏色最好，Sartorius CN 140膜的線更集中些，故選擇Sartorius CN 140膜為本實(shí)驗(yàn)最適的NC膜。

圖6　不同NC膜制備的試紙條的比較Fig.6　Comparing of different NC membranes in ICG

2.7檢測抗原（FB1-BSA）與金標(biāo)抗體量的確定

從圖7中可以看出，質(zhì)控線（C線）的形態(tài)均良好，且顏色強(qiáng)度適中。比較檢測線（T線），隨著檢測抗原和金標(biāo)抗體的量增大，檢測線的顏色逐漸增強(qiáng)，但考慮小分子物質(zhì)試紙條檢測的競爭性原理，為提高檢測的靈敏度，故選擇了檢測抗原相對較少的200 μg/mL、金標(biāo)抗體14 μL/cm的組合為最適組合。

圖7　檢測抗原與金標(biāo)抗體量的確定Fig.7　Confirming the quantity of FB1-OVAand McAb of gold nanoparticle-McAb probe

2.8膠體金試紙條的靈敏度

FB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0、5、10、20、30、50 ng/mL，平行測定3次。其試紙條檢測靈敏度的結(jié)果如圖8所示。隨著FB1濃度的增加，檢測線的顏色強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，?dāng)FB1濃度大于20 ng/mL時，肉眼可見檢測線顏色完全消失，呈陽性。因此，確定該試紙條檢測靈敏度為20 ng/mL。

圖8　膠體金免疫層析快速檢測試紙條的靈敏度Fig.8　The sensitivity of the ICG

2.9膠體金試紙條的穩(wěn)定性

每組試紙條測試3次，間隔3個月。從圖9可以看出，3~12月之間，試紙條處于穩(wěn)定的狀態(tài)，試紙條檢測線和控制線顏色和靈敏度無明顯變化，背景清晰；因此，確定該試紙條可在4℃，密閉的條件貯存12個月。

圖9　膠體金免疫層析快速檢測試紙條的穩(wěn)定性Fig.9　Stability of gold colloid test strip

2.10膠體金試紙條的特異性

采用制備好地試紙條，將測定液中分別只含DON、ZEN、OTA、AFB1和FB1平行測定3次，由圖10可以看出，4種真菌毒素在兩個不同濃度下，均顯示兩條明顯的紅線，說明這四種真菌毒素和金標(biāo)記的FB1抗體不與NC膜上的檢測抗原發(fā)生競爭反應(yīng)，說明該單抗與其他真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。而FB1在低濃度或高濃度下，T線顯色明顯有區(qū)別，說明該試紙條對FB1具有較高的特異性。

圖10　膠體金試紙條的交叉反應(yīng)Fig.10　Cross reactivity of the test strip with other toxins

2.11實(shí)際樣品的測定

圖11　實(shí)際玉米樣品的檢測Fig.11　Detection of fumonisin B1with immunochromatographic strip maize samples

表2　三種檢測方法檢測實(shí)際玉米樣品的比較（n=3）Table 2　Comparison of the three detection methods to detect the FB1in corn samples（n=3）

由圖11和表2可知，試紙條的檢測結(jié)果和高效液相、ELISA的檢測結(jié)果一致，在實(shí)際樣品的檢測中可以先采用試紙條對樣品進(jìn)行大規(guī)模的初步篩查，確定陽性樣品，然后采用HPLC等方法對相關(guān)樣品進(jìn)行定量分析，既能節(jié)約檢測時間，還可以節(jié)約檢測成本，故說明該試紙條具有較好的實(shí)用性。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體按照14 μL/cm噴于金標(biāo)墊上，200 μg/mL的檢測抗原FB1-BSA（T線）和1.0 mg/mL的羊抗鼠二抗（C線）按照0.74 μL/cm噴涂于硝酸纖維素膜（NC膜），然后組裝成試紙條，該試紙條檢出限為20 ng/mL，檢測時間只需5 min，試紙條穩(wěn)定性可達(dá)12個月無需專業(yè)人員和儀器，可直接目測其結(jié)果，特別適合現(xiàn)場快速檢測。

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［19］李巖松.玉米中伏馬菌素免疫學(xué)快速篩查方法的研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2011.

Development of an immunochromatographic test strip for the rapid detection of fumonisin B1

REN Wen-jie，HUANG Zhi-bing*，XU Yang，LI Yan-ping，TU Zhui，SU Bao-wei，JI Yan-wei
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-Germany Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Objective：An immunochromatographic test strip（ICG）had been developed for rapid detection of fumonisin B1residues in maize samples.Methods：For this purpose，F(xiàn)B1coupled to bovine serum albumin（BSA）via the modified EDCA method was prepared as capture antigen.The colloidal gold was prepared by the reduction of tetrachloroauric（III）acid trihydrate with citric acid trisodium salt.Results：Using an antibody purified by the ammonium sulfate precipitation，and a titer of the antibody was about 1.28×105by ELISA.The ICG was composed of NC membrane，sample pad，probe pad（colloidal gold-monoclonal antibody probes for FB1and absorbent pad.Moreover，the sensitivity，specificity and stability of the ICG were also detected.A total of 0.74 μL/cm of FB1-BSA（200 μg/mL）and the goat anti-mouse IgG antibody（1.0 mg/mL）were sprayed onto the NC membrane as the test（T line）and control lines（C line），respectively.The sensitivity of the test strip was 20 ng/mL.The test could be accomplished within 5 min.The stability of the ICG was about 12 months at 4℃. Conclusion：Analysis of FB1in maize samples revealed that data obtained from the ICG were in good agreement with those obtained from HPLC and ELISA.The results demonstrated that the ICG could be used as qualitative tool for rapid screening of FB1on-site.

rapid detection；immunochromatographic strip test；fumonisin B1；maize

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0058-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.003

2015－03－20

任文潔（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：真菌毒素的檢測，E-mail：renwenjie0818@qq.com。

黃志兵（1975-），男，博士，研究方向：食品安全快速檢測，E-mail：hzbchem@163.com。

江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜?jì)劃（KJLD12052）；江西省科技廳項(xiàng)目（20121BBG70059）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160308）。