江曉波，王　　萌，張　　麗，劉利萍，張　　利，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川雅安625014；2.德陽市環(huán)境監(jiān)測中心站，四川德陽618000；3.四川幼兒師范高等?？茖W(xué)校，四川綿陽621000）

黃花蒿殘膏的揮發(fā)性成分分析及其抑菌和抗氧化活性研究

江曉波1，2，王萌3，張麗1，劉利萍1，張利1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川雅安625014；2.德陽市環(huán)境監(jiān)測中心站，四川德陽618000；3.四川幼兒師范高等?？茖W(xué)校，四川綿陽621000）

采用無水乙醇浸提法提取黃花蒿殘膏中的揮發(fā)性成分，對其成分進(jìn)行GC-MS分析，并通過紙片抑菌實(shí)驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)對揮發(fā)油抑菌和抗氧化活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明：黃花蒿殘膏揮發(fā)油中鑒定出包括石竹烯氧化物（15.27%）、樟腦（8.71%）和冰片（8.57%）在內(nèi)的29種成分，占總揮發(fā)油的81.23%。紙片法抑菌活性測試表明黃花蒿殘膏揮發(fā)油對四種實(shí)驗(yàn)供試菌均有明顯的抑制作用，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.5%＜MIC＜1%，而枯草桿菌的則為0.25%＜MIC＜0.5%。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明該揮發(fā)油具有一定的DPPH自由基清除能力和還原能力，且隨著濃度增大抗氧化活性增強(qiáng)。本研究表明了黃花蒿殘膏揮發(fā)油在生產(chǎn)提取青蒿素后仍然保留部分有價值的成分，表現(xiàn)出抑菌和抗氧化活性，具有潛在的經(jīng)濟(jì)開發(fā)利用價值。

黃花蒿，殘膏，揮發(fā)油，抑菌活性，抗氧化活性

黃花蒿（Artemisia annua L.），別名青蒿，菊科蒿屬一年生草本植物，性寒味苦，是我國傳統(tǒng)中藥，民間用作消暑、泄熱、止汗等［1-2］。其有效成分青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，是國內(nèi)外公認(rèn)的抗瘧藥物［3］。在青蒿素提取和精制的工業(yè)化生產(chǎn)中，產(chǎn)生的大量殘膏被用作潤滑劑或廢棄，不但造成資源浪費(fèi)，而且對環(huán)境嚴(yán)重污染。據(jù)初步研究顯示，黃花蒿殘膏中含有大量以揮發(fā)油為主的活性成分，該類物質(zhì)能應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等多個領(lǐng)域［4-7］，因此殘膏具有潛在的研究和利用價值。本研究通過對黃花蒿殘膏中的揮發(fā)油進(jìn)行成分分析及抑菌和抗氧化活性研究，以期為黃花蒿殘膏的開發(fā)利用供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃花蒿殘膏（植物油抽提溶劑提取分離黃花蒿中青蒿素后殘留的黃色膏狀物） 成都川湘生化有限公司提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma公司；特丁基對苯二酚（TBHQ） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉、正己烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鋇、硫酸、無水乙醇等均為分析純成都市科龍化工試劑廠；蛋白胨生化試劑，杭州微生物試劑有限公司；牛肉膏生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏陽性菌：枯草桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli），鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀美國安捷倫科技公司；LDZX-40SAI型立體式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Buchi R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士Buchi有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵河南鞏義英峪儀器廠；移液槍上海賽默飛世爾公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1揮發(fā)油的制備取一定量的黃花蒿殘膏溶解于20倍95%乙醇，溶解溫度控制在50～60℃。將溶解好的殘膏乙醇溶液自然降溫到室溫（25～30℃），析出大部分蠟質(zhì)，在此溫度下用定性濾紙?jiān)?0kPa下迅速減壓過濾，濾液收集冷藏于4℃環(huán)境下，保持2h后迅速取出于90kPa下減壓過濾。以上所得濾液在40℃水浴，90kPa真空條件下蒸發(fā)濃縮即得殘膏揮發(fā)油［8］。

1.2.2揮發(fā)油成分分析采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對揮發(fā)油成分進(jìn)行分析。

氣相條件：HP-5 MS 5%Phenyl Methyl Siloxane（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱，載氣為高純度氦氣（99.999%），分流比為20∶1，分流流量20mL/min，流速1mL/min。進(jìn)樣量1μL，程序升溫從50℃開始，保持1min，然后以5℃/min升至250℃，保持4min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70eV，溶劑延時5min，掃描范圍40～550amu。

1.2.3紙片法測定抑菌效果

1.2.3.1菌懸液的制備將4種供試菌種分別接于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃下振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行菌種活化，挑取活化的菌于平板固體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種的分離純化，挑取單個菌落再次接種于液體培養(yǎng)基中，對純化的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，最后將菌液稀釋配制成含菌量106cfu/mL的菌懸液，備用。

1.2.3.2揮發(fā)油抑菌效果的測定用打孔器將干凈的濾紙制成直徑為6mm的小圓濾紙片，高溫干燥滅菌后備用。在超凈臺里將制備的菌懸液注入平板，涂布均勻。將制作好的濾紙片于揮發(fā)油中浸潤處理使其充分吸收，隨后將濾紙片瀝干平鋪在含菌平板上，每個平板貼3片相同黃花蒿揮發(fā)油的濾紙片，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，干濾紙片作為空白對照，0.8%TBHQ做陽性對照。將接好的菌置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，取出測量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值［9］。

1.2.3.3最低抑菌濃度（MIC）的測定用無水乙醇將揮發(fā)油溶解配制成0.25%、0.5%、1%、2%和4%五種不同濃度，將濾紙片浸潤其中充分吸收，瀝干平鋪在含菌平板上，同一濃度貼3片濾紙片于同一平板中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，無水乙醇做空白對照。將接好的菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后取出測量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，以剛好產(chǎn)生抑菌圈所對應(yīng)的樣品濃度為該樣的最小抑菌濃度（MIC）［9］。

1.2.4抗氧化活性評價

1.2.4.1DPPH自由基清除活性測定以無水乙醇為溶劑，將揮發(fā)油配制成一系列濃度梯度的樣品溶液。分別取各樣品2mL置于不同的試管中，再分別加入2×10-4mol/L的DPPH溶液2mL，混勻，室溫避光反應(yīng)30min，最后在517nm波長處測吸光值。DPPH溶液和樣品溶液分別做空白對照，測定吸光值。以上實(shí)驗(yàn)平行測定3次，取其平均值。清除率按以下公式計(jì)算：

清除率（%）=［A0-（A1-A2）/A0］×100

式中，A0為2mL DPPH溶液+2mL無水乙醇的吸光值；A1為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶液的吸光值；A2為2mL無水乙醇+2mL樣品溶液的吸光值。根據(jù)樣品濃度與其清除率的關(guān)系，計(jì)算DPPH自由基清除率到達(dá)50%時揮發(fā)油濃度IC50（實(shí)驗(yàn)以抗氧化劑TBHQ作為對照）［10］。

1.2.4.2三氯乙酸法還原力測定以無水乙醇為溶劑，將揮發(fā)油配制成一系列濃度梯度的樣品溶液。取2.5mL樣品溶液于試管中，依次加入2.5mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L，pH=6.6）和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，于50℃水浴中保溫20min后快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在波長700nm處測定其吸光度值（以蒸餾水作參比溶液），吸光度越高還原力越強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)平行測定3次，取其平均值［11］。

2　結(jié)果與分析

2.1殘膏揮發(fā)油成分分析

對黃花蒿殘膏揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，鑒別出揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，利用峰面積歸一化法確定各組分相對含量，結(jié)果見表1。

由表1可知，該揮發(fā)油共分析鑒定出29種成分，占揮發(fā)油總量的81.23%。主要的成分是石竹烯氧化物（15.27%）、樟腦（8.71%）和冰片（8.57%），含量較高的其他成分有順式-Z-α-環(huán)氧紅沒藥烯（6.09%）、反式-Z-α-環(huán)氧紅沒藥烯（5.58%）、α-芹子烯（4.68%）、β-芹子烯（3.43%）、桉樹腦（3.38%）、石竹烯（3.33%）、α-長葉蒎烯（3.13%）、白菖烯（2.50%）、香橙烯氧化物（2.39%）、2-甲基-4-（2，2，6-三甲基-1-環(huán)己烯基）-2-丁烯醛（2.20%）、α-蒎烯（1.94%）、（E）-β-金合歡烯（1.42%）、異長葉烯酮（1.41%）、傘花烴（1.31%）等。其中萜類化合物為該揮發(fā)油主要組成部分，有27個化合物，占78.74%（包括單萜成分及其衍生物為12個，占25.64%，倍半萜及其衍生物15個，占53.10%）；酯和醛類占少量的比例，分別為0.29%和2.20%。萜類化合物是一類重要的天然香料，在醫(yī)藥工業(yè)，化妝品和食品工業(yè)等具有一定的應(yīng)用價值。Chavan等從番荔枝樹皮中提取石竹烯氧化物，作用于小鼠，證明了其具有很好鎮(zhèn)痛抗炎作用［12］，樟腦和冰片等是某些醫(yī)用藥劑的重要及主要成分［13］，路路通揮發(fā)油中的β-蒎烯可用作生產(chǎn)香料、合成VE等的原料，（E）-2-己烯醛被廣泛應(yīng)用于香料的調(diào)配，檸檬烯等可以作為添香劑［14］，因此該殘膏揮發(fā)油具有這些領(lǐng)域的潛在利用價值。

表1　黃花蒿殘膏的揮發(fā)油成分分析Table 1　Chemical composition of the volatile oil from residues

2.2紙片法測定殘膏揮發(fā)油抑菌活性

2.2.1揮發(fā)油抑菌效果采用濾紙片擴(kuò)散法測定黃花蒿殘膏揮發(fā)油的抑菌效果，結(jié)果見表2。由表2可知該揮發(fā)油對2種具有致密細(xì)胞壁的革蘭氏陽性菌和2種細(xì)胞壁較疏松的革蘭氏陰性菌都有不同程度的抑菌作用，具有抑菌活性。此外，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌，該揮發(fā)油抑菌效果比實(shí)驗(yàn)所用濃度的TBHQ（0.8%）的抑菌效果差，而對鼠傷寒沙門氏菌，該揮發(fā)油表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

表2　殘膏揮發(fā)油的抑菌效果（mm）Table 2　Inhibition zone diameters of the essential oil from residuesagainst 4 test strains（mm）

2.2.2MIC的測定揮發(fā)油對四種供試菌的最小抑菌濃度結(jié)果如表3所示。由表3結(jié)果可知，黃花蒿殘膏揮發(fā)油對四種菌的抑制作用均隨揮發(fā)油濃度的增加呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌在1%濃度揮發(fā)油作用下都產(chǎn)生明顯抑菌圈，0.5%作用時無明顯抑菌圈產(chǎn)生，因此這三種菌0.5%＜MIC＜1%。而枯草桿菌的最小抑菌濃度則為0.25%＜MIC＜0.5%。

表3　黃花蒿揮發(fā)油最低抑菌濃度Table 3　MICs of the essential oil from residues against 4 test strains

2.3抗氧化活性測定

2.3.1DPPH自由基清除能力測定對黃花蒿殘膏揮發(fā)油的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示，圖2為抗氧化劑TBHQ的清除能力對照。由圖1看出揮發(fā)油表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，隨著揮發(fā)油濃度的增大，自由基清除能力增強(qiáng)。由計(jì)算知，當(dāng)揮發(fā)油濃度達(dá)到5.24%時，DPPH的清除率達(dá)到50%，即IC50為5.24%。而TBHQ的IC50為0.0071%，對比該抗氧化劑，揮發(fā)油的清除能力相對較弱。

2.3.2三氯乙酸法還原力測定抗氧化劑的還原力是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。因此，可通過測定還原力來評價其抗氧化活性的大小［15］。對黃花蒿殘膏揮發(fā)油的還原力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。由圖3看出不同濃度的該揮發(fā)油具有強(qiáng)弱不同的還原能力，隨著濃度增大，吸光度增大，還原能力逐漸增強(qiáng)。

圖1　殘膏揮發(fā)油DPPH自由基清除能力Fig.1　DPPH free radical scavenging activity of volatile oil from residues

圖2TBHQ的DPPH自由基清除能力Fig.2　DPPH free radical scavenging activityof TBHQ

圖3　殘膏揮發(fā)油還原力Fig.3　Reducingpower of volatile oil from residues

3　結(jié)論

通過本研究證實(shí)經(jīng)提取青蒿素后的黃花蒿殘膏揮發(fā)油仍含有多種未被破壞的活性物質(zhì)，如相對百分含量較高的石竹烯氧化物（15.27%）、樟腦（8.71%）和冰片（8.57%）等，這些萜類化合物等在生活中常被用于食品、醫(yī)藥、化妝品等，由于其功能特殊、用途廣泛，開發(fā)前景廣闊［9］。而抗氧化活性和抑菌能力實(shí)驗(yàn)中，揮發(fā)油展現(xiàn)出一定的抗氧化能力和對多種細(xì)菌的抑制活性。因此，不僅在組成成分方面，而且在活性實(shí)驗(yàn)方面都體現(xiàn)出黃花蒿殘膏中的揮發(fā)油仍存在利用價值。

目前提取分離青蒿素后的黃花蒿浸提殘余物含較高比例的蠟質(zhì)等，如何高效分離其中的有效成分是合理利用該殘膏的關(guān)鍵問題，同時分離后大量蠟質(zhì)仍可以再次回收利用。因此，合理開發(fā)利用黃花蒿殘膏揮發(fā)油，具有潛在的市場應(yīng)用價值。

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Study on the chemical composition，antibacterial and antioxidant activity of volatile components in residues from Artemisia annua L.

JIANG Xiao-bo1，2，WANG Meng3，ZHANG Li1，LIU Li-ping1，ZHANG Li1，*
（1.College of Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Deyang Environmental Monitoring Centre Station，Deyang 618000，China；3.Sichuan Preschool Educators College，Mianyang 621000，China）

In the study，volatile components in residues were obtained by ethanol extraction and analyzed by GC-MS.The antibacterial and antioxidant activity were separately determined by paper diffusion method and antioxidant experiment in vitro.The result showed that 29 components，including caryophylleneoxide（15.27%），camphor（8.71%）and borneol（8.57%），were identified in this volatile oil，representing 81.23%of the total detected constituents.According to the vitro tests of inhibitory bacteria，the essential oil had inhibitory effects on four tested microorganisms.The MIC of volatile oil was between 0.25%and 0.5%for Bacillus subtilis.And they were between 0.5%and 1%for the other bacteria.In the antioxidation experiments，the volatile oil had ability to scavenge DPPH free radical and reducing power to a certain extent.Above all，some active ingredients were still in residues and these residues processed a certain developing value.

Artemisia annua L.；residues；volatile oil；antimicrobial activity；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-0306（2015）14-0103-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.011

2014－11－03

江曉波（1989-），男，碩士研究生，研究方向：植物化學(xué)與成分分析。

張利（1969-），女，教授，研究方向：植物資源評價與利用。

國家科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（14C26215102921）；四川省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014FZ0056）；四川省科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（13CX02806098）；四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（14NZ0018）。