陳蘆地 吳金香** 王正堯 謝遠(yuǎn)志

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（泉州 362000）

2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖男科

輔助生殖技術(shù)中鋅抑制精子氧化損傷作用*

陳蘆地1吳金香1**王正堯1謝遠(yuǎn)志2

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（泉州 362000）

2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖男科

目的 探討輔助生殖技術(shù)中鋅對(duì)精子損傷的保護(hù)作用。方法 以輔助生殖技術(shù)中常用的密度梯度離心法優(yōu)選后的精子為研究對(duì)象，以過(guò)氧化氫為損傷刺激物，應(yīng)用國(guó)聯(lián)精子檢測(cè)系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡以及精子DNA碎片分析試劑盒的方法比較精子的活力與存活率，精子質(zhì)膜完整性以及精子DNA碎片形成，從而分析鋅抑制過(guò)氧化氫對(duì)精子的損傷作用。結(jié)果 過(guò)氧化氫刺激后精子的活動(dòng)力與存活率差，精子質(zhì)膜完整性破壞，大量精子DNA損傷，而鋅能明顯保護(hù)精子的損傷作用。結(jié)論 精子損傷與氧化刺激密切相關(guān)，在輔助生殖技術(shù)中鋅可抑制精子的損傷作用。

精子； 活性氧； 生殖技術(shù), 輔助； 鋅

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，ROS增加影響精子質(zhì)量以及精子DNA完整性，從而導(dǎo)致不孕，反復(fù)流產(chǎn)，胎兒畸形等［1,2］。輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中精子體外優(yōu)選處理、冷凍及復(fù)蘇過(guò)程中導(dǎo)致的精子氧化損傷影響著精液常規(guī)的各項(xiàng)指標(biāo)［3］。鋅是男性體內(nèi)精子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的微量元素。大量研究表明［4-6］，體內(nèi)鋅具有抗氧化作用，然而ART中鋅能否保護(hù)精子受氧化刺激的損傷作用，目前尚無(wú)研究，本研究在優(yōu)選后的精子中加入適量的鋅，通過(guò)比較精子的活動(dòng)力與存活率以及精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)和精子DNA碎片檢測(cè)判斷鋅能否抑制過(guò)氧化氫的氧化損傷作用，旨在判斷ART中鋅能否抑制精子受氧化刺激的損傷作用。

材料和方法

一、材料

10例正常健康男性精液樣品，取自本院有生育能力的青年自愿者，年齡25～30（26±2）歲。ZnCl2為瑞士Adamas-beta公司產(chǎn)品。30% H2O2由西隴化工股份有限公司提供。40%上層梯度離心液、80%下層梯度離心液和洗精液均為美國(guó)Quinn's公司產(chǎn)品。膨脹液購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司。精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒購(gòu)于深圳博銳德生物科技有限公司。精子質(zhì)量分析系統(tǒng)為北京國(guó)聯(lián)醫(yī)療技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 OLYMPUS. CX31型光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。

二、方法

本研究設(shè)計(jì)不同的濃度梯度的H2O2（0.1%,0.01%和0.001%）和ZnCl2（50,25,12.5,6.2 nmol L-1），應(yīng)用國(guó)聯(lián)精子檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)精子的存活率和活力來(lái)選擇最佳的干預(yù)濃度為0.001% H2O2和12.5 nmol L-1ZnCl2。10份正常精液標(biāo)本，置37℃水浴箱待液化，分別用40%和80%高密度離心液制備梯度液，300×g，離心15min獲取優(yōu)質(zhì)精子，Quinn's洗精液300×g，離心5min洗滌優(yōu)質(zhì)精子2次后將精子密度至5～10×109/L，每份0.3mL平均分為3組：（1）ZnCl2+H2O2組 含12.5 nmol L-1ZnCl2及0.001%的H2O2；（2）H2O2組 含0.001% H2O2；（3）空白組 加入等體積0.9% NaCl2。3組同時(shí)置37℃，5% CO2孵箱中孵育5h和24h后分析不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異。

（一）精子活動(dòng)力與存活率的分析

3組同時(shí)置37℃，5% CO2孵箱中孵育5h和24h后，用國(guó)聯(lián)精子檢測(cè)系統(tǒng)觀察精子運(yùn)動(dòng)功能的變化，從而判斷精子的活動(dòng)力與存活率。

（二）精子質(zhì)膜完整性的判斷

應(yīng)用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估精子質(zhì)膜的完整性：3組實(shí)驗(yàn)分別取100μL樣品置1mL膨脹液中靜置37℃，5min后，各取10μL于潔凈載玻片，并覆蓋上蓋玻片，隨機(jī)選取視野觀察（×400倍），計(jì)數(shù)200個(gè)精子，按以下公式計(jì)算出質(zhì)膜完整精子百分率：

（三）精子DNA碎片的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法進(jìn)行檢測(cè)：3組實(shí)驗(yàn)分別取60μL參照精子DNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DNA完整的精子在經(jīng)過(guò)變性和去掉核蛋白后DNA擴(kuò)散形成特征性的光暈，而存在DNA碎片的精子不會(huì)產(chǎn)生這種特征性的光暈。根據(jù)光暈的有無(wú)和大小判斷精子DNA的完整程度。精子DNA碎片判斷標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部?jī)H產(chǎn)生較小的光暈或無(wú)光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過(guò)精子頭部最小直徑的1/3，（如圖1）。隨機(jī)選取視野觀察（×400倍），計(jì)數(shù)500個(gè)精子，按以下公式計(jì)算出存在DNA碎片精子百分率：

圖1 精子DNA碎片檢測(cè)示意圖SDF： 精子DNA碎片（Sperm DNA fragmentation）； SDI：精子DNA完整（Sperm DNA integrity）

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組的均數(shù)比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、鋅對(duì)過(guò)氧化氫影響優(yōu)選后精子活力與存活率的保護(hù)作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2作用下精子運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，明顯低于同時(shí)加入適量ZnCl2的實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3組精子孵育5h和24h后活力與存活率的比較（n=10,s, %）

表1 3組精子孵育5h和24h后活力與存活率的比較（n=10,s, %）

與空白組比較, *為P＜0.05； 與H2O2組比較, #P＜0.05； 與5h比較, △為P＜0.05

活力 存活率5h 24h 5h 24h空白組 84.25 78.61 94.2 92.14 H2O2組 3.43* 0*△ 23.24* 0*△ZnCl2+ H2O2組 26.14*# 0.79*△# 61.32*# 6.35*△#

二、鋅對(duì)優(yōu)選后精子抑制過(guò)氧化氫損傷精子質(zhì)膜的作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后H2O2具損傷精子質(zhì)膜的作用，且損傷程度明顯高于同時(shí)加入適量ZnCl2的實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)圖2。

三、鋅對(duì)優(yōu)選后精子保護(hù)過(guò)氧化氫損傷精子DNA的作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2刺激下精子DNA完整性嚴(yán)重破壞，DNA損傷程度明顯高于同時(shí)加入適量ZnCl2的實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 3組精子質(zhì)膜完整度比較（n=10,s, %）

圖3 3組精子DNA損傷程度比較（n=10,s, %）

討 論

鋅是人體內(nèi)必需的200多金屬-酶的作用微量營(yíng)養(yǎng)素之一，它在男性的生育能力至關(guān)重要的作用。鋅的缺乏可影響精子發(fā)生和降低血清睪酮水平［7］。有研究表明，它在正常睪丸的生長(zhǎng)、精子發(fā)生和精子生理學(xué)中的作用。精漿中的鋅由前列腺分泌，其作為精漿中的一種微量元素，對(duì)精子的發(fā)生、成熟和獲能具有一定的作用［8］。

輔助生殖技術(shù)是治療不孕癥的主要方法。然而輔助生殖技術(shù)精子體外操作過(guò)程中密度梯度離心的精子優(yōu)選方法以及凍結(jié)和復(fù)蘇等技術(shù)會(huì)導(dǎo)致精子的氧化損傷，影響精液參數(shù)。精漿是抗氧化劑的天然環(huán)境，精子抗氧化作用依賴(lài)于精漿中提供的天然抗氧化系統(tǒng)如維生素C和E，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽等直接作用的自由基清除劑［9］。然而在輔助生殖技術(shù)操作過(guò)程中使精子失去精漿的保護(hù)作用以及抗氧化能力。在現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)和不孕不育的診療過(guò)程中，如何改善不孕患者體內(nèi)抗氧化應(yīng)激功能以及提高男性生育能力，已經(jīng)得到了相當(dāng)?shù)闹匾暎?0］。

人體在正常情況下，精子中活性氧的產(chǎn)生和清除存在動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)對(duì)精子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不利的影響。目前國(guó)內(nèi)外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能與炎癥、凋亡、氧化損傷以及環(huán)境因素等多種因素作用相關(guān)［11-13］。當(dāng)男性生殖系統(tǒng)發(fā)生缺氧、炎癥以及ART前期對(duì)精子的離心、冷凍及復(fù)蘇等會(huì)產(chǎn)生高水平的ROS，超過(guò)了精子自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力，從而導(dǎo)致精子質(zhì)膜的過(guò)氧化和DNA損傷。男性精子DNA碎片化的形成造成精子內(nèi)部遺傳信息的不完整，嚴(yán)重影響生育情況，會(huì)導(dǎo)致不孕，反復(fù)流產(chǎn)，胎兒畸形，造成胎兒發(fā)育停滯，輔助生殖失敗等。

本研究主要采用ART中優(yōu)選的精子為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以過(guò)氧化氫為氧化刺激物，通過(guò)適量的ZnCl2進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)國(guó)聯(lián)精子軟件分析、低滲腫脹實(shí)驗(yàn)以及精子DNA碎片的檢測(cè)判斷鋅能否抑制過(guò)氧化氫對(duì)精子的氧化損傷作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在ART中適量的鋅是能保護(hù)精子抗氧化刺激作用，不僅能提高精子的活動(dòng)力與存活率，還抑制過(guò)氧化氫對(duì)精子質(zhì)膜的損傷作用，同時(shí)降低過(guò)氧化氫對(duì)精子DNA的損傷作用。鋅抗氧化作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，該實(shí)驗(yàn)為將來(lái)的進(jìn)一步機(jī)制研究以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)；在本研究中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)基中Zn2+濃度遠(yuǎn)低于精漿中的Zn2+濃度，主要是Zn2+在體內(nèi)不同部位的濃度分布不一，ART中應(yīng)用的培養(yǎng)基主要是參照輸卵管液，可見(jiàn)在輸卵管位置Zn2+的量明顯少于精漿。

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（2015-08-18收稿）

Zinc protects sperm from being damaged by reactive oxygen species in assisted reproductive technology*

Chen Ludi1, Wu Jinxiang1**, Wang Zhengyao1, Xie Yuanzhi2
1. Department of Clinical Laboratory, Second Hospital Affi liated to Fujian Medical University, Quanzhou 362000, China 2. Department of Reproductive of Andrology, Second Hospital Affi liated to Fujian Medical University Corresponding author： Wu Jinxiang, E-mail： pursuer@163.com

Objective To explore the protective action of zinc insperm damage during assisted reproductive technology. Methods Preferring the sperm samples which were selected by density gradient centrifugation in assisted reproductive technology were used for the study. Uder stimulation of hydrogen peroxide, sperm motility, viability, sperm membrane integrity and DNA fragmentation were detected by Goodline sperm detection system, optical microscopy and sperm DNA fragmentation assay kit respectively, and the effect of Zinc on sperm damage from hydrogen peroxide was evaluated. Results The motility and vitality of sperms were decreased, the membrane integrity was destroyed and lots of sperm DNA were damaged under hydrogen peroxide stimulation. However, Zinc could protect sperm from damage obviously. Conclusion Sperm injury is closely associated with oxidative stimulation. Zinc could induce sperm damage in assisted reproductive technology.

spermatozoa； reactive oxygen species； reproductive techniques, assisted； Zinc

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.10.002

R 321. 1

資助： 福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項(xiàng)目（NO.2011-1-36）； Project supported by the Youth Research Foundation of Fujian Provincial Department of Health（NO.2011-1-36）

**通訊作者, E-mail： pursuer@163.com