程瑛　張世文　劉彩云　黃斌　毛玉花　逯彥果

（甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站，天水741020）

蜜蜂巢脾蜂膠復(fù)合生物制劑抑制溫棚作物真菌類病害的試驗(yàn)研究

程瑛張世文劉彩云黃斌毛玉花逯彥果

（甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站，天水741020）

番茄病害是露地、保護(hù)地作物常見且比較難防治的真菌類病害，為了使其得到有效控制，從而提高產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量，本研究擬采用蜜蜂巢脾、蜂膠及中草藥為主要原料，篩選出一種能抑制番茄真菌類病害生長繁殖的生物制劑。經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抑制真菌試驗(yàn)，抑菌率達(dá)到80%以上。

蜜蜂巢脾；蜂膠；生物制劑；番茄；真菌病害；抑菌

蜜蜂巢脾是蜜蜂棲息、繁衍育子、貯存食物的場所，當(dāng)一個巢脾繁育過十幾代蜂后，需要更換新的巢脾，被廢棄的陳舊巢脾藥用性在于它上面的繭衣、殘留的蜂產(chǎn)品、幼蟲分泌物等。陳舊蜂巢浸液對真菌等都有很強(qiáng)的抑制力，能預(yù)防經(jīng)濟(jì)作物很多生理性病害。

蜂膠是工蜂從植物幼芽或樹干上采集來的樹脂、樹液、植物色素和揮發(fā)油，并混入其上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成的一種芳香性膠狀固體物。它對致病細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲等，有抑制或殺滅作用，具有“天然廣譜抗生素”美稱。

中草藥蒼耳子屬菊科一年生草本植物。其煎劑對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其丙酮或乙醇提取物對紅色毛癬菌也有抑菌作用。黃連屬多年生草本，大黃是多年生高大草本，均具有抗菌消炎抗病原微生物等作用，有效成分分別為小檗堿、黃連堿、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等。

隨著城市化進(jìn)程的加快，人們對蔬菜的需求猛增，出現(xiàn)了種植番茄的專業(yè)村和專業(yè)基地，但由于品種單一，倒茬困難，致使連作現(xiàn)象非常嚴(yán)重，多年的連茬栽培使田間番茄病害的基數(shù)逐年增多。這就為某些病蟲害的發(fā)生提供了有利條件，其中以灰霉病、早疫病、晚疫病等最為典型，病原分別由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、致病疫霉（Phytophthora infestans）侵染引起，有逐年加重的趨勢。此類病菌繁殖迅速，危害番茄的整個生育期和全株，其防治主要依賴化學(xué)藥物，但長期單一、大量和連續(xù)地使用，勢必會造成植物的抗藥性，而超量使用化學(xué)農(nóng)藥又會導(dǎo)致嚴(yán)重的“3R”問題。只能輪換、交替或混合使用化學(xué)殺菌劑，才能取得較好的控制效果。但是卻沒有得到全面有效的防治，仍是番茄病害及儲存番茄腐爛的重要因素。因此，本研究擬在實(shí)驗(yàn)室提取并篩選蜜蜂巢脾、蜂膠及中草藥混合物為天然復(fù)合制劑，對溫棚番茄灰霉菌、早疫病及晚疫病等真菌類病害具有較高防治效果，且對人畜無毒害，不污染環(huán)境，對目標(biāo)生物具有安全無污染的特點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1蜜蜂巢脾

蜂場采集的中、意蜂老巢脾；蜂膠：蜂場采集的毛膠；中草藥（黃連、蒼耳子、大黃）：市售；無水乙醇、聚乙二醇400（PFG400）、聚山梨酯80（T80）等。

1.1.2供試菌種

采集甘肅省天水市武山縣漆家莊馬師傅家的溫棚患有真菌類的農(nóng)作物（選擇茄果類蔬菜如番茄、茄子等），經(jīng)過在實(shí)驗(yàn)室分離篩選、純培養(yǎng)，并觀察其菌落形態(tài)、鏡檢所得的灰霉菌（Botrytis cinerea）、早疫病菌（Alternaria solani）以及晚疫病（Phytophthora infestans）菌種。

供試品種：秦蔬一號。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），黑麥培養(yǎng)基。

1.1.4儀器

恒溫滋力攪拌器（78HW-1型）、顯微鏡（DN-117M）、高壓蒸汽滅菌鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺（SW-CJ-ID型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（PE-52A）、移液器、牛津杯、平皿、電爐子、水浴鍋等。

1.2實(shí)驗(yàn)材料提取方法

1.2.1蜜蜂巢脾浸提液的提取方法

將廢舊巢脾在-20℃冷凍→粉碎→按1:4（W/V）的物料比，取已粉碎的老巢脾，加水（或50%、95%加醇）→熬煮20min（或浸泡）→過60目篩→濾液靜止冷卻→過200目篩→將已制得的樣品放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行蒸餾，放入冰箱冷藏備用。

1.2.2蜂膠乙醇液的提取

粗蜂膠500g→砸碎→按1:4（W/V）的物料比、加食用酒精2000ml→浸泡（約7d左右）→過篩（去蜂尸、木屑、蠟渣）→加入螯合劑（除鐵屑等重金屬）→靜置→吸濾→蜂膠乙醇液。

1.2.3中草藥液

將中草藥分別粉碎，各稱取50g，用紗布包好，加水500ml，煮沸30min，過濾，濾渣中加水250ml，煮沸約20min，過濾，合并兩次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮以上藥液，分別至50ml（即1ml提取物相當(dāng)于1g原藥），封口，放于冰箱冷藏保存。

1.2.4蜜蜂巢脾復(fù)合制劑（以下簡稱生物制劑）工藝流程

分別量取一定量的蜂膠加入乳化劑（聚乙二醇-400、T-80）在恒溫磁力攪拌器上攪拌約40min，加巢脾液和中草藥液，攪拌1h，溫度50℃，充分?jǐn)嚢瑁b瓶。

1.2.5正交試驗(yàn)

確定了巢脾、蜂膠以及中草藥提取液三種因素的組成比例，見表1。

1.3抑菌實(shí)驗(yàn)方法

牛津杯法（管碟法）抑菌方法。

1.3.1制平板

將培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至55～60℃時(shí)，在超凈工作臺上給每個平皿（專用培養(yǎng)皿內(nèi)徑90mm，高16～17mm）先倒入15ml的PDA培養(yǎng)基（為底層）；將灰霉病菌、早疫病菌及晚疫病菌等分別培養(yǎng)至平板的2/3大時(shí)，在無菌條件下，用接種針刮取孢子，倒入放有數(shù)粒玻璃珠的三角瓶中，搖5min，（用滅菌的雙層紗布過濾于另一個滅菌的三角瓶內(nèi)。用低倍鏡檢查，調(diào)節(jié)孢子濃度，每個視野80～100個孢子為宜）。將已制備好的孢子懸液取3ml，加入另一個三角瓶中，向其中倒入冷卻至50℃的30ml的培養(yǎng)基，充分混勻。立即取5ml帶菌培養(yǎng)基加在已凝固的瓊脂培養(yǎng)基上，使其均勻鋪在已有15ml的平板上。

表1　水平因素表

1.3.2藥液選取

根據(jù)正交試驗(yàn)每種病菌配制有九組樣品，滅菌水為對照。

1.3.3實(shí)驗(yàn)

用滅菌鑷子取不銹鋼小管（即牛津杯，外徑8.0mm，內(nèi)徑6.0mm，高10mm），每個平板內(nèi)中央放1個小管，周圍等距離放3個小管，其中央一個為對照，加入無菌水，周圍3個小管加不同濃度的藥液。用記號筆標(biāo)記，重復(fù)兩組實(shí)驗(yàn)，放入26℃左右的恒溫箱中培養(yǎng)，觀察。經(jīng)培養(yǎng)5～7天后，取出平板，用直尺十字交叉法測量菌絲生長直徑（見表2）。

2　結(jié)果與分析

2.1抑菌實(shí)驗(yàn)

2.1.1將采用不同提取方法提取的蜜蜂巢脾液、蜂膠液及中草藥液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。其中1號樣是水提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，2號樣是95%醇提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，3號樣是50%醇提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，4號樣為蜂膠乙醇液，5號樣為蒼耳子、黃連、大黃中草藥復(fù)合提取液。

通過對蜜蜂巢脾液、蜂膠乙醇液以及中草藥液等進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生對灰葡萄孢菌、茄鏈格孢菌、致病疫霉菌的抑菌圈，可以看出，蜂膠乙醇液對灰葡萄孢菌、茄鏈格孢菌、致病疫霉菌有較強(qiáng)的抑制作用，其次為采用水提法提取的巢脾液及中草藥提取液均對其有

表2　蜜蜂巢脾、蜂膠及中草藥對番茄真菌類病害的抑制效果

抑菌效果。所以采用水提法提取的巢脾液、蜂膠乙醇液以及中草藥液作為復(fù)合生物制劑的原料。

2.1.2根據(jù)三因素三水平的正交試驗(yàn)（無交互作用）條件下配制生物制劑，以PEG400溶液為有機(jī)相，采用T80作為復(fù)合乳化劑，共配制9組樣品。見表3。

2.2.3將所配制的復(fù)合生物制劑進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

通過生物制劑在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散作用，產(chǎn)生對病菌的抑菌圈。從表4可以看出，D號樣品抑制灰霉病效果最強(qiáng)，G號樣品抑制早疫病效果最強(qiáng)，A號樣品抑制晚疫病效果最強(qiáng)。

表3　巢脾、蜂膠、中草藥正交試驗(yàn)表

2.2.3不同稀釋倍數(shù)的抑菌實(shí)驗(yàn)

將篩選出D號樣（水平組合A2B1C2）、G號樣（水平組合A3B1C3）、A號樣（水平組合A1B1C1）的復(fù)合生物制劑分別用滅菌水稀釋為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%等不同濃度，滅菌水為對照。化學(xué)農(nóng)藥為陽性對照。采用牛津杯法，進(jìn)行抑制灰霉病、早疫病、晚疫病的抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

由表5及圖1可以得出，不同濃度的生物制劑均有不同的抑菌效果，將D號樣稀釋成50%濃度時(shí)，抑制灰霉菌效果明顯較強(qiáng)，稀釋成60%濃度時(shí)，雖然抑菌效果也有增加，但是抑菌效果不太顯著；G號樣稀釋成40%濃度時(shí)，抑制早疫病效果較強(qiáng)；A號樣稀釋成40%濃度時(shí)，抑制晚疫病效果較強(qiáng)；抑菌效果與濃度成正相關(guān)，且隨著濃度的增加抑菌效果越強(qiáng)。遵循低成本高效益的原則，選擇稀釋濃度為50%的D號樣為抑制灰霉病最佳生物制劑配方；選擇稀釋濃度為40%的G號樣為抑制早疫病最佳生物制劑配方；選擇稀釋濃度為40%的A號樣為抑制晚疫病最佳生物制劑配方。

表4　復(fù)合生物制劑對番茄真菌類病害的抑菌結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3　結(jié)論

番茄真菌類病害對冬春季節(jié)溫棚番茄生產(chǎn)影響很大，在生產(chǎn)中提前預(yù)防，在發(fā)病前和發(fā)病初期及時(shí)用藥，可以增強(qiáng)抗病力，從而減輕病害的發(fā)生，提高產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量。利用廢棄的蜜蜂巢脾將其提取，可變廢為寶，成本低廉，添加蜂膠以及中草藥，研制開發(fā)的生物制劑能有效防治作物真菌類病害，且無毒副作用，開發(fā)前景十分廣闊。

表5　不同稀釋倍數(shù)的復(fù)合生物制劑對番茄真菌類病害的抑制效果統(tǒng)計(jì)表

圖1　不同濃度生物制劑對番茄真菌類病害的抑菌作用

［1］劉波，等.對多菌靈速克靈具有多重抗性的灰霉菌菌株性質(zhì)的研究〔J〕.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993.16（3）：50-54.

［2］徐國鈞.中草藥彩色圖譜（第三版）.2013，福建科學(xué)技術(shù)出版社.

［3］張子君，等.不同培養(yǎng)基對番茄早疫病菌菌絲生長的影響.遼寧

農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（4）17-18.

［4］曹靜，等.對番茄晚疫病有抑抑制作用的植物提取物篩選.北方園藝，2009（7）130-131.