孫才云，方 玲，萬 驥，傅 婷，王 丹，唐云明

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

蕹菜葉酪氨酸酶的分離純化與部分性質(zhì)

孫才云，方 玲，萬 驥，傅 婷，王 丹，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

蕹菜葉經(jīng)勻漿、緩沖液提取、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Superd ex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的酪氨酸酶。該酶活力達(dá)到114.53 U/mg，酶活力回收率為11.33%，純化倍數(shù)為99.59。全酶分子質(zhì)量為77.60 kD，亞基分子質(zhì)量為38.70 kD；最適溫度為45 ℃，最適pH值為7.5，該酶在25～55 ℃及pH 6.0～8.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；在最適條件下測得其Km值為10.05 mmol/L；甲醇、乙醇、異丙醇及檸檬酸、抗壞血酸、Ca2+和Pb2+對(duì)該酶有抑制作用，Mn2+、Zn2+和Co2+對(duì)該酶具有一定的激活作用，尿素和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）對(duì)該酶活性影響不大，Li+、K+對(duì)該酶活性基本沒有影響。

蕹菜葉；酪氨酸酶；分離純化；性質(zhì)

酪氨酸酶（tyrosinase，TYR，EC1.14.18.1）是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基含銅氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)植物及人體內(nèi)［1］。兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，能將單酚加氧成二酚，又可以將二酚等多元酚氧化成醌［2］。不僅是生物體合成黑色素等產(chǎn)生色斑的關(guān)鍵酶［3］，并且參與多酚類物質(zhì)的形成［4］。植物中的酪氨酸酶主要與酚類代謝、植物抗病有關(guān)［5］。它可以誘導(dǎo)植物抗?fàn)I養(yǎng)防御反應(yīng)，降低對(duì)食草動(dòng)物的營養(yǎng)作用，而且對(duì)細(xì)菌有抑制作用，防止細(xì)菌擴(kuò)散［6］。目前，酪氨酸酶被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境、食品、精細(xì)化工等領(lǐng)域［7］，如在食品工業(yè)中，一方面由于酪氨酸酶氧化酚類物質(zhì)生成黑色素，降低了其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味［6］，因此抑制酪氨酸酶具有重要的意義；另一方面為了增加色調(diào)，有意加入酪氨酸酶，如紅茶的制作、葡萄干和棗的曬制、啤酒生產(chǎn)等［7］。因此獲得來源廣泛、成本低廉的酪氨酸酶并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行研究具有重要的理論和經(jīng)濟(jì)意義。

蕹菜（Ipomoea aquatica Forsk.），又稱空心菜，為旋花科甘薯屬一年生或多年生草本蔬菜，具有產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、病蟲害少等優(yōu)點(diǎn)，是堵缺補(bǔ)淡的首選蔬菜［8］。本實(shí)驗(yàn)從蕹菜葉中分離純化了TYR，并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究，不僅可以為尋求蕹菜酪氨酸酶的抑制劑提供參考，還可以提供一種廉價(jià)易得的酪氨酸酶來源，從而提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蕹菜，購自于重慶市北碚區(qū)天生路永輝超市。

左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、考馬斯亮藍(lán)R-250、牛血清白蛋白 美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司；DEAE-Sephrose、Superdex-200分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國GE公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Milli-Q plus純水儀 美國Millipore公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀儀器有限公司；AL204精密電子天平、Seven Easy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；AKTA Prime plus純化系統(tǒng) 美國GE公司；垂直電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；MC4L冷凍干燥機(jī) 德國Uni-Equip公司。

1.3方法

1.3.1粗酶液的制備

取蕹菜葉200.00 g清洗干凈，晾干后剪碎，按照1∶4（m/V）的比例立即加入預(yù)冷的800 mL 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl的提取緩沖液和4.00 g的PVPP；放入組織勻漿機(jī)中勻漿，置4 ℃冰箱提取3 h，經(jīng) 紗過濾后得到濾液，在4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2硫酸銨分級(jí)沉淀

向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至20%飽和度，4 ℃冰箱靜置鹽析2.5 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min收集上清液；繼續(xù)緩慢加入硫酸銨粉末至65%飽和度，4 ℃冰箱靜置鹽析3 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心45 min收集沉淀；沉淀用預(yù)冷的50 mmol/L pH 7.7的Tris-HCl緩沖液完全溶解，用5 mmol/L pH 7.7的Tris-HCl透析液，4 ℃條件下透析過夜，得到酶液并保存。

1.3.3DEAE-Sepharose離子交換層析

用50 mmol/L pH 7.7 Tris-HCl緩沖液平衡層析柱后，取1.3.2節(jié)中得到的酶液10 mL上柱，含有0～1.0 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 7.7 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，每管收集5 mL，流速設(shè)定為0.5 mL/min，共收集65 管，測定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的幾管，經(jīng)透析后冷凍干燥備用。

1.3.4Superdex-200 凝膠過濾層析

層析柱經(jīng)過50 mmol/L pH 7.7 Tris-HCl緩沖液平衡處理后，取1.3.3節(jié)中冷凍干燥的TYR用50 mmol/L pH 7.7 Tris-HCl緩沖液溶解，每次上柱5 mL，用50 mmol/L pH 7.7 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，共收集60 管，每管收集3 mL，流速設(shè)定為0.3 mL/min，測定各管酶活力以及蛋白含量，收集酶活力較高的幾管，經(jīng)透析后冷凍干燥得到酶的樣品，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5TYR活力的測定

［9］并作修改：酪氨酸酶活力的測定是基于L-DOPA的酶催化氧化產(chǎn)物——多巴色素（dopachrome）在475 nm波長處有最大吸收，其吸光系數(shù)為ε= 3 700 mol/（L·cm）。酶活力單位定義為以每分鐘多巴色素在475 nm波長處的光密度值增加0.001為一個(gè)酶活力單位（U）。因此，通過測定酶催化反應(yīng)體系的OD475nm隨時(shí)間的增長曲線，從直線斜率即可求得酶活力。

1.3.6蛋白質(zhì)含量測定

采用Bradford法［10］以及紫外分光光度法［11］對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。

1.3.7TYR分子質(zhì)量測定和純度鑒定

采用凝膠過濾法對(duì)全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測定［12］，用SDS-PAGE對(duì)1.3.4節(jié)中得到酶活力最高管的樣品進(jìn)行純度鑒定以及亞基分子質(zhì)量的測定［13］。

1.3.8蕹菜葉TYR部分性質(zhì)的研究

1.3.8.1蕹菜葉TYR最適溫度和熱穩(wěn)定性研究

分別在20～75 ℃（間隔5 ℃）條件下測定酶活力（以最適溫度條件下測定的酶活力為100%）確定其最適溫度。將適量的酶液分別置于不同溫度（25～75 ℃，間隔10 ℃）條件下，每間隔1 h測定該酶活力，測定1～5 h，以原酶液在35 ℃測得的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，研究其熱穩(wěn)定性。

1.3.8.2蕹菜葉TYR最適pH值和pH值穩(wěn)定性研究

分別在pH 4.0～10.0條件下測定酶活力確定其最適pH值；將適量的酶液分別保存于pH 4.0～10.0的緩沖液中，每間隔30 min測定該酶活力，測定30～150 min，研究其pH值穩(wěn)定性。二者均以最適條件下測得的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.8.3蕹菜葉TYR的Km的測定

設(shè)置底物L(fēng)-DOPA濃度（2、4、6、8、10 mmol/L），在最適溫度和最適pH值條件下測定TYR的活力，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）［14］求出該酶的Km值。

1.3.8.4不同有機(jī)溶劑對(duì)蕹菜葉TYR活性的影響

分別將甲醇、異丙醇、乙醇與適量的酶液混合，使混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，在25 ℃條件下保溫30 min后，在最適條件下分別測定其活性。以酶液在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同有機(jī)溶劑后測得的酶活力與之相比得相對(duì)酶活力。

1.3.8.5不同化合物對(duì)蕹菜葉TYR活性的影響

將乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraaceticacid，EDTA）、尿素、抗壞血酸、SDS、檸檬酸配成100 mmol/L母液，按一定的比例與適量的酶液混合，混合后終濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L；在25 ℃條件下保溫30 min后，在最適條件下分別測定其活性。以酶液在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同化合物后測得的酶活力與之相比得相對(duì)酶活力。

1.3.8.6不同金屬離子對(duì)蕹菜葉TYR活性的影響

將金屬離子（Mn2+、Ca2+、Zn2+、Pb2+、Co2+、Li+、K+）配制成10 mmol/L母液，再按一定比例分別與適量的酶液混合，混合后終濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L，在25 ℃條件下保溫30 min后，在最適條件下分別測定其活性。以酶液在最適條件下測得酶活力為100%，加入不同金屬離子后測得的酶活力與之相比得相對(duì)酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1蕹菜葉TYR的分離純化結(jié)果

經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀透析后的酶液經(jīng)DEAE-Sepharose層析結(jié)果見圖1，酶活性最高管為第20管，酶活性峰集中在第17～23管，收集酶活性較高的幾管酶液，透析并冷凍干燥后上Superdex-200層析柱，結(jié)果見圖2，酶活性最高管為第40管，收集酶活性較高幾管的酶液，透析冷凍干燥后于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。整個(gè)分離純化過程結(jié)果見表1。

圖1　蕹菜葉TYR的DEAE-Sepharose離子交換柱層析結(jié)果Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

圖2　蕹菜葉TYR的Superdex-200凝膠過濾層析結(jié)果Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

表1　蕹菜葉TYR的分離純化結(jié)果Table 1 Purification of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

2.2蕹菜葉TYR純度鑒定和分子質(zhì)量測定結(jié)果

蕹菜葉TYR純化后，經(jīng)SDS-PAGE顯示單一條帶（圖3），說明該酶樣品達(dá)到電泳純，通過遷移率推算出該酶亞基的分子質(zhì)量為38.70 kD；而通過凝膠過濾層析法測定的全酶分子質(zhì)量約為77.60 kD（圖4），可以推斷出蕹菜葉TYR是由兩個(gè)相同的亞基組成。

圖3　蕹菜葉TYR的SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

圖4　Superdex-200凝膠過濾法測得蕹菜葉TYR的全酶分子質(zhì)量Fig.4 Estimation of molecular weight of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves by Superdex-200 gel filtration

2.3蕹菜葉TYR部分性質(zhì)研究

2.3.1蕹菜葉TYR最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖5可知，TYR的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。由圖6可知，在25～55 ℃范圍內(nèi)，該酶的穩(wěn)定性較好；超過55 ℃，隨著溫度的升高，酶活力明顯下降；其中在75 ℃保溫2 h后，酶活力幾乎全部喪失。

圖5　溫度對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

圖6　蕹菜葉TYR的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

2.3.2蕹菜葉TYR最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖7　pH值對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

圖8　蕹菜葉TYR的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

由圖7可知，該酶的最適pH值為7.5。由圖8可知，在pH 6.0～8.0時(shí)酶穩(wěn)定性較好，酶活力變化趨勢比較平緩；當(dāng)pH＜6.0或＞8.0時(shí)，酶蛋白分子結(jié)構(gòu)受到破壞，酶活力迅速下降，其中當(dāng)pH 4.0時(shí)，150 min后酶活力僅剩10%，當(dāng)pH值為10.0時(shí)，150 min后酶活力僅剩15%，說明該酶對(duì)酸堿比較敏感。

2.3.3蕹菜葉TYR米氏常數(shù)的測定結(jié)果

圖9　雙倒數(shù)法測蕹菜葉TYR的米氏常數(shù)Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

如圖9所示，經(jīng)計(jì)算，蕹菜葉TYR對(duì)L-DOPA的Km值為10.05 mmol/L。

2.3.4不同有機(jī)溶劑對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響

圖10　不同有機(jī)溶劑對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of TY R from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

由圖10可知，該酶在異丙醇、甲醇、乙醇3 種有機(jī)溶劑作用下，活性均受到了強(qiáng)烈的抑制，隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，這種抑制作用越強(qiáng)。特別是異丙醇，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，該酶活力僅剩10%，3 種有機(jī)溶劑對(duì)該酶的抑制強(qiáng)弱依次為異丙醇＞乙醇＞甲醇。

2.3.5不同化合物對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響

圖11　不同化合物對(duì)蕹菜葉TYR活性的影響Fig.11 Effects of various compounds on the activity of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

由圖11可知，隨著化合物濃度的增大，幾種化合物對(duì)該酶活性都表現(xiàn)出了抑制作用，其中，抗壞血酸、檸檬酸對(duì)該酶的抑制作用非常明顯，尿素和SDS對(duì)該酶活性影響不大，EDTA在0～40 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)酶活性有明顯的抑制作用，濃度超過40 mmol/L，則對(duì)該酶活性不再有影響。

2.3.6不同金屬離子對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響

圖12　不同金屬離子對(duì)蕹菜葉TYR活力的影響Fig.12 Effects of various metal ions on the activity of TYR from Ipomoea aquatica Forsk. leaves

由圖12可知，不同金屬離子對(duì)蕹菜葉TYR活性有不同的影響。隨著金屬離子濃度的增加，Mn2+、Zn2+和Co2+對(duì)酶活性有一定的激活作用，Ca2+和Pb2+對(duì)該酶均有較強(qiáng)的抑制作用，其中Pb2+對(duì)該酶的抑制作用最強(qiáng)烈，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)到3 mmol/L時(shí)，TYR酶活性幾乎完全喪失。Li+、 K+對(duì)該酶活性基本沒有影響。

3　結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以蕹菜葉為材料，經(jīng)過勻漿、沉淀、層析等步驟后，從蕹菜葉中成功分離純化得到電泳純TYR，該酶活力達(dá)到114.53 U/mg，酶活回收率為11.33%，純化倍數(shù)為99.59，與胡源等［15］報(bào)道的從馬鈴薯中分離純化出的酪氨酸酶（回收率為18.44%，純化倍數(shù)為50）和鄒宇等［16］報(bào)道的黑木耳中分離純化出的酪氨酸酶（回收率為27.41%，純化倍數(shù)為21.43）相比，回收率偏低，但純化倍數(shù)較高?；厥章势偷脑蚴寝巢巳~的酪氨酸酶存在著同工酶［17］，純化過程中丟失了同工酶，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以通過改進(jìn)方法，獲得更好的分離效果。

蕹菜葉TYR最適溫度為45 ℃，低于香樟果實(shí)（50 ℃）［5］，高于克氏原螯蝦（35 ℃）［18］、雙胞蘑菇（30 ℃）［1］；該酶最適pH值為7.5，與香樟果實(shí)（pH 7.5）［5］相同，與家蠅（pH 7.4）［19］相近，低于南美白對(duì)蝦（pH 8.0）［20］，高于小菜蛾（pH 6.4）［21］；該酶的Km值為10.05 mmol/L，低于香樟果實(shí)（12.83 mmol/L）［5］，高于中國對(duì)蝦（1.99 mmol/L）［22］。說明不同來源的TYR在酶學(xué)性質(zhì)方面存在一定的差異，可能與其生存環(huán)境、物種甚至組織源性不同有關(guān)，也可能與研究中所用緩沖液、底物的種類和濃度不同有關(guān)［23］。

蕹菜葉TYR亞基分子質(zhì)量為38.70 kD。高于鏈霉菌（30.72 kD）［24］，黑木耳（12.62 kD）［9］；低于人體（60.40 kD）［25］和中國對(duì)蝦（77 kD）［22］；與香樟果實(shí)（43 kD）［5］相近。TYR分子質(zhì)量大小的不同可能原因是種屬差異造成的，或者可能與其生存環(huán)境的差異及其長期的分離進(jìn)化有關(guān)［23］。

有機(jī)溶劑甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)蕹菜葉TYR活性有較強(qiáng)的抑制作用，推測原因是加入有機(jī)溶劑后破壞了水化層，降低了溶液的極性，使酶分子中維持構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，從而改變了酶的構(gòu)象。Ca2+和Pb2+對(duì)蕹菜葉TYR均有較強(qiáng)的抑制作用，推測原因可能是該酶的競爭性抑制劑，或者它們能夠與活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，作為重金屬離子，高濃度會(huì)使該酶變性而達(dá)到抑制作用。Mn2+、Zn2+和Co2+對(duì)酶活性有一定的激活作用，很可能是通過促進(jìn)底物與該酶活性中心的親和力進(jìn)而有利于酪氨酸酶活性發(fā)揮來實(shí)現(xiàn)的，或者可能參與該酶酶原的激活過程［22］。Li+、K+對(duì)該酶活性基本沒有影響，其中K+主要考慮為是細(xì)胞內(nèi)外常見離子，主要中和陰離子的電荷，保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，長期的進(jìn)化過程使得細(xì)胞對(duì)這些離子濃度變化有著嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制［26］。檸檬酸對(duì)該酶的抑制作用非常明顯，原因可能是其降低了反應(yīng)體系的pH值，并螯合酶活性中心的銅離子而使酶失活［1］，抗壞血酸對(duì)該酶的抑制作用強(qiáng)烈，這與張曉晴等［5］報(bào)道的香樟果實(shí)酪氨酸酶的性質(zhì)一致。

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Isolation， Purification and Characterization of Tyrosinase from Ipomoea aquatica Forsk. Leaves

SUN Caiyun， FANG Ling， WAN Ji， FU Ting， WANG Dan， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development， M inistry of Education， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Electrophoresis-purity tyrosinase （TYR） from Ipomoea Aquatica Forsk leaves was obtained through homogenization， buffer soluti on extraction， ammonium sulfate precipitation， DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. The specific activity of purified TYR was 114.53 U/mg， with a recovery of 11.33% and a purification factor of 99.59. The molecular weights of TYR and its subunit were 77.60 kD and 38.70 kD，respectively. TYR was relatively stable in the range of 25-55 ℃ and pH 6.0-8.0. Its optimum temperature and pH were 45 ℃ and 7.5， respectively. Furthermore， its Kmwas 10.05 mmol/L under the optimum conditions. The activity of TYR could be inhibited by methanol， ethanol， isopropanol and citric acid and ascorbic acid， as well as some metal ions such as Ca2+and Pb2+. It could be activated by Mn2+， Zn2+and Co2+； however， urea and SDS had little effect on its activity， and Li+and K+has no effect on its activity.

Ipomoea aquatica Forsk. leaves； tyrosinase； isolation and purification； characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）15-0167-06

10.7506/spkx1002-6630-201515031

2014-10-30

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC，2011AB1027）

孫才云（1988—），男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：suncai1237@126.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn