趙洪源，贠建民，邵曉慶，齊 丹

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

涼州熏醋釀造中高產(chǎn)乙偶姻醋酸菌菌株篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

趙洪源，贠建民*，邵曉慶，齊 丹

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

四甲基吡嗪是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要風(fēng)味物質(zhì)，而乙偶姻（acetoin，ACT）是其生物合成前體。本實(shí)驗(yàn)從涼州熏醋醋醅中分離出了200 株產(chǎn)酸菌株，利用Voges-Proskauer（V-P）顯色反應(yīng)法初篩得到了28 株產(chǎn)乙偶姻的菌株，用火焰離子化檢測器結(jié)合氣相色譜（gas chromatograph-fl ame ionization detector，GC-FID）法復(fù)篩得到了一株高產(chǎn)乙偶姻的菌株C92，經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上使用Design-Expert設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度31.31 ℃、接種量8.27%、pH 6.55、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min，此條件下乙偶姻產(chǎn)量最大，達(dá)到19.04 g/L，比原始發(fā)酵產(chǎn)量高35.8%，證明C92菌株是一株在食醋釀造過程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株。

涼州熏醋；巴氏醋酸桿菌；乙偶姻；響應(yīng)面優(yōu)化

涼州熏醋因其獨(dú)特的風(fēng)味而聞名［1］，如何增加傳統(tǒng)發(fā)酵食醋的風(fēng)味已成為近年來的研究熱點(diǎn)［2-3］。前期研究表明，涼州熏醋的特征性風(fēng)味物質(zhì)主要為揮發(fā)性的四甲基吡嗪，它與其他揮發(fā)性成分共同作用，是使涼州熏醋呈現(xiàn)后味厚重悠長特點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)［4］。乙偶姻（acetoin，ACT）又名3-羥基-2-丁酮，是多種微生物糖代謝的中間產(chǎn)物，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品重要香氣成分四甲基吡嗪生物合成的前體物質(zhì)［5-6］。

近年來，有關(guān)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中功能性物質(zhì)的來源及機(jī)理已成為本領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，如Besson［7］、Larroche［8］等研究發(fā)現(xiàn)，通過添加外源的蘇氨酸和乙偶姻可以有效提高四甲基吡嗪產(chǎn)量，并對四甲基吡嗪經(jīng)微生物代謝途徑的形成機(jī)理進(jìn)行了研究且兩種物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性極大［9］。但外源添加過量乙偶姻，則會導(dǎo)致產(chǎn)物抑制現(xiàn)象和細(xì)胞毒性，細(xì)胞代謝平衡紊亂［10］，導(dǎo)致前體乙偶姻的利用率很低［7］。Zhu Bingfeng等［11］對中國白酒中四甲基吡嗪的微生物產(chǎn)生途徑及代謝機(jī)理進(jìn)行了深入研究，驗(yàn)證了中國白酒中四甲基吡嗪產(chǎn)生的主要途徑來源于微生物的代謝反應(yīng)，并非美拉德反應(yīng)，并證明了乙偶姻和氨是發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的前體物質(zhì)［12］，且二者共同作用發(fā)生非酶促反應(yīng)生成了四甲基吡嗪。

醋酸菌在釀醋過程中發(fā)揮著產(chǎn)酸的重要功能，并賦予涼州熏醋特殊的風(fēng)味物質(zhì)，在釀醋工業(yè)中有著極其重要的作用，而目前關(guān)于產(chǎn)高產(chǎn)乙偶姻的醋酸菌的報(bào)道較少。Xu Wei等［13］在鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選到了1 株產(chǎn)乙偶姻的醋酸菌，Danilo等［14］報(bào)道了一株Acetobacter hansenii產(chǎn)乙偶姻量達(dá)到8.93 g/L。因此，食醋釀造行業(yè)急需開發(fā)具有優(yōu)良風(fēng)味特性的乙偶姻生產(chǎn)菌株，使其能夠利用還原糖代謝產(chǎn)生并內(nèi)源積累前體乙偶姻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)四甲基吡嗪以提高熏醋風(fēng)味的目標(biāo)。因此，開發(fā)篩選高產(chǎn)乙偶姻的醋酸菌菌株，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，對傳統(tǒng)釀醋工業(yè)的現(xiàn)代化改造過程中風(fēng)味穩(wěn)定具有十分重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

分離材料為甘肅省云曉涼州熏醋傳統(tǒng)食醋釀造料醅。

蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂 上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；葡萄糖氧化酶試劑盒 上海執(zhí)誠生物技術(shù)有限公司；2-庚酮、3-羥基-2-丁酮（均為色譜純） 美國Sigma Aldrich公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、普通DNA純化試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；葡萄糖、肌酸、NaOH、K2HPO4、NaH2PO4均為國產(chǎn)分析純。

醋酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、瓊脂20.0 g/L、碳酸鈣20.0 g/L，121 ℃濕熱滅菌30 min，待其冷卻為50 ℃后加入3%～5%無水乙醇，分裝于無菌培養(yǎng)皿中，制成碳酸鈣平板分離培養(yǎng)基。

Voges-Proskauer（V-P）培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%，pH值調(diào)至7.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏1.2%、NaCl 0.05%、MgSO40.15%、MnSO40.02%、KH2PO40.1%、（NH4）2SO40.1%，調(diào)pH值至7.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖8.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏2%、NaCl 0.05%、MgSO40.15%、MnSO40.02%、KH2PO40.1%、（NH4）2SO40.5%，調(diào)pH值至7.0，于 121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

pHS-3C酸度計(jì) 上海綠宇精密儀器制造有限公司；HG303-4A電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市光明醫(yī)療儀器廠；CS101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器上海三申醫(yī)療器械有限公司；CP214電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；GC 6890N氣相色譜儀、DB-WAX色譜柱 美國Agilent Scientific公司；頂空固相微萃取裝置、DVB/CAR/PDMS萃取器 美國Surpelco公司。

1.3方法

1.3.1高產(chǎn)乙偶姻醋酸菌菌株的篩選

1.3.1.1醋酸菌菌株的分離篩選

分離篩選流程：樣品采集→取樣→梯度稀釋→傾注法培養(yǎng)→單菌落分離→醋酸菌定性實(shí)驗(yàn)→菌種鑒定→保藏。

稱取10 g醋醅樣品于已滅菌的裝有90 mL無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中， 30 ℃恒溫振蕩 30 min，即為10-1稀釋菌懸液。取1.0 mL 10-1菌懸液于盛有9 mL無菌水的試管中，依次用無菌水稀釋，獲得最終稀釋倍數(shù)為10-2～10-7的培養(yǎng)液。選取3 個合適的稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL菌懸液于滅菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做2 個平行，然后將45 ℃左右的培養(yǎng)基注入平皿中，待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h［15］。

1.3.1.2高產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選［16］

將以從涼州熏醋醋醅中篩選的醋酸菌株接種于裝有50 mL V-P培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃條件下150 r/min培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液加入改良O'Meara試劑，振蕩1～2 min，37 ℃條件下反應(yīng)60 min，觀察顏色變化，紅色為V-P反應(yīng)陽性，在最大吸收波長處測定其光密度值，根據(jù)光密度值比較初篩菌株的乙偶姻產(chǎn)量。以培養(yǎng)基滅菌后不接種30 ℃培養(yǎng)48 h的樣品為對照。選取初篩乙偶姻產(chǎn)量最高的5 株菌株以氣相色譜法（gas chromatograph，GC）進(jìn)行復(fù)篩，得到產(chǎn)乙偶姻量最高的醋酸菌菌株。

1.3.2篩出菌株的鑒定［17］

1.3.2.1生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［18］，對該產(chǎn)酸菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢有無、接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、運(yùn)動性、葡萄糖發(fā)酵、乙醇氧化、乙酸氧化、淀粉水解、甘油生酮實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)葡萄糖酸、產(chǎn)5-酮基葡糖酸鹽、GYC產(chǎn)水溶性色素、生二酮葡萄糖酸鹽、產(chǎn)γ-吡喃酮實(shí)驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.3.2.216S rRNA序列分析測定

將提取的基因組DNA委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增序列測序。測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，將得到的16S rRNA序列通過BLAST程序提交，在NCBI在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列檢索［19］。將目標(biāo)菌株和應(yīng)用BLAST檢索到的與之同源性較高菌株的16S rRNA利用GenBank基因序列作最大同源性比較分析。

1.3.3高產(chǎn)乙偶姻菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，分別對培養(yǎng)溫度、pH值、裝液量和接種量（體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行單因素試驗(yàn)（培養(yǎng)溫度分別控制在26、28、30、32、34 ℃；培養(yǎng)基初始pH值分別控制在5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；搖床轉(zhuǎn)速分別為90、120、150、180、210 r/min；接種量分別控制在3%、5%、7%、9%、11%），發(fā)酵時間為48 h，取樣離心，取上清液－20 ℃條件下保存待測。

1.3.3.2響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素條件優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上使用Design-Expert對條件因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以得到對菌株發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻有顯著影響的因素的最佳組合［20-21］。

1.3.4檢測方法

1.3.4.1初篩產(chǎn)乙偶姻的菌株［22］

初篩采用V-P顯色配合分光光度計(jì)法，將菌株接種于V-P培養(yǎng)基中，在150 r/min條件下，于30 ℃環(huán)境中培養(yǎng)48 h，取上清液1 mL，加入1.0 mL改良O'Meara（含0.3%肌酸、0.5%蛋白胨的40% NaOH水溶液）試劑。搖晃2 min，37 ℃條件下反應(yīng)60 min后觀察其顏色變化，反應(yīng)液呈紅色表明有乙偶姻生成。將反應(yīng)液取出后，搖勻，并測定出反應(yīng)液在516 nm處具有最大吸收波長。根據(jù)516 nm波長處光密 度值的大小判斷各菌株代謝葡萄糖生成乙偶姻的能力。

1.3.4.2火焰離子化檢測器結(jié)合氣相色譜（gas chromatograph fl ame ionization detector，GC-FID）復(fù)篩高產(chǎn)乙偶姻的菌株

分別配制10、20、40、80、160、320、640 mg/L的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取5 mL上述溶液，進(jìn)樣GC 6890N氣相色譜儀測定。發(fā)酵液經(jīng)離心，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以2-庚酮為內(nèi)標(biāo)物，二氯甲烷為萃取劑，進(jìn)行萃取后通過GC分析定量。氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax（15 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口與檢測器溫度均為250 ℃，載氣為氮?dú)猓魉贋? mL/min，升溫程序：80 ℃恒溫2 min，再以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃。

以乙偶姻與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)，乙偶姻質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.006 0x－0.017 2（R2=0.999 2）。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選結(jié)果

2.1.1產(chǎn)酸菌株的篩選結(jié)果

通過CaCO3透明圈共從涼州熏醋醋醅中篩選出200 株微生物，將每株菌株進(jìn)行純化并保存在斜面中以供使用。

2.1.2V-P反應(yīng)初篩結(jié)果

經(jīng)V-P反應(yīng)得到結(jié)果呈陽性的醋酸菌菌株28 株，如表1所示，在516 nm波長處測量其光密度值，選取其中OD516nm最大的菌株C92為初篩菌株。

表1　菌株V-P反應(yīng)初篩結(jié)果Table 1 V-P reaction screening of strains

2.1.3GC-FID復(fù)篩高產(chǎn)乙偶姻菌株結(jié)果

將初篩菌株接種于裝有50 mL YPG培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，用GC-FID法檢測上清液中乙偶姻的含量。以培養(yǎng)基滅菌后不接種30 ℃培養(yǎng)48 h的樣品為對照，結(jié)果如表2所示，其中C92菌株發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的量達(dá)到14.02 g/L，高于其他菌株。

表2　GC-FID復(fù)篩高產(chǎn)ACT菌株結(jié)果Table 2 GC-FID screening of ACT-producing strains

2.2菌株鑒定

2.2.1菌株的生理生化鑒定結(jié)果

表3　篩出菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strain

由表3可知，C92菌株是一株無芽孢、革蘭氏陰性、GYC水溶圈陽性的短桿狀細(xì)菌，通過對比，發(fā)現(xiàn)該菌株與Acetobacter pasteurianus特性十分相符。

2.2.2菌株的16S rRNA鑒定結(jié)果

對篩出的C92菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列分析鑒定［23］，取其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1　C92菌株的16S rRNA基因序列電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplified products of 16S rRNA sequence from strain C92

C92菌株基因組DNA經(jīng)通用引物擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，在約1 500 bp的位置出現(xiàn)了清晰的條帶。將純化后的PCR產(chǎn)物切膠回收委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行16S rRNA測序，結(jié)果顯示該條帶大小為1 412 bp（GenBank登錄號AY883035），提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對，與巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）同源性為99.2%，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征鑒定，確定C92為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.3產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

圖2　菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Effects of culture conditions on the yield of ACT

由圖2A可知，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，C92菌株產(chǎn)ACT的能力最強(qiáng)，表明穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值有利于C92菌株生長及生成相應(yīng)的酶，過高或過低的pH值會使得C92菌株代謝異常［24］。由圖2B可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速增大，C92菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT的量隨之增大，在180 r/min達(dá)到最大值15.37 g/L，這一結(jié)果表明，C92菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT的量與氧氣的供應(yīng)成正相關(guān)，巴氏醋酸桿菌發(fā)酵生成ACT為好氧發(fā)酵［16］。由圖2C可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度從26 ℃增加到32 ℃時，ACT產(chǎn)量隨之增加，并且在32 ℃時的產(chǎn)量大約是26 ℃產(chǎn)量的2 倍。然而，當(dāng)培養(yǎng)溫度增加到34 ℃時，ACT產(chǎn)量出現(xiàn)下降，這可能是由于細(xì)胞調(diào)節(jié)與代謝異常造成的，隨著溫度的升高，菌體代謝產(chǎn)生ACT的關(guān)鍵酶活性亦隨之提高，但當(dāng)溫度超過32 ℃后，菌體及代謝酶受高溫抑制，使ACT產(chǎn)量降低［25］。由圖2D可知，ACT的產(chǎn)量隨菌株接種量的增大而增加，從3%（9.05 g/L）到7%（14.02 g/L）依次增加，然后保持在穩(wěn)定的水平不變（9%和11%）。

2.3.2菌株產(chǎn)乙偶姻的響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.3.2.1二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析［26］

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到菌株在培養(yǎng)溫度32 ℃、培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量7%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min時，乙偶姻具有最大產(chǎn)量。采用Design-Expert 8.0軟件，選用中心復(fù)合模型，對發(fā)酵條件做四因素三水平共30 個試驗(yàn)點(diǎn)（5 個中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表4所示。

經(jīng)回歸擬合后，得到以發(fā)酵液中乙偶姻產(chǎn)量為響應(yīng)值的回歸方程為Y=－404.169 4+20.734 2A－1.494 7B+ 15.119 4C+0.496 4D+0.076 5AB+0.645 3AC+ 1.806 3×10－3AD－0.147 3BC－3.304 2×10－3BD－0.016 7CD－0.341 7A2－0.306 2B2－1.414 7C2－7.891 0×10－4D2。

表4　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design and results for response surface analysis

用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，其方差分析結(jié)果見表5。從表中可以看出，該模型在α=0.01的水平上高度顯著，說明模型的預(yù)測值和實(shí)際值非常吻合，模型成立。各因素中一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對乙偶姻產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng) BD 對乙偶姻產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）；而AB、AD、CD的影響不顯著。同時回歸方程相關(guān)系數(shù) R2=0.983 1，模型F=62.33，說明響應(yīng)值的變化有98.31%來源于所選變量，即培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速4 個因素的變化是造成ACT產(chǎn)量不同的主要原因。回歸方程失擬項(xiàng)P＞0.05，F(xiàn)=1.39，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定最佳發(fā)酵條件。

根據(jù)表5中各因素對于菌株生產(chǎn)ACT產(chǎn)量影響的F值，可以看出搖床轉(zhuǎn)速對菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT影響最大，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH值次之，接種量影響最小。搖床轉(zhuǎn)速影響到培養(yǎng)基中的溶氧情況，對微生物的生長繁殖及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)都有很重要的影響。

表5　回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance （ANOVA） for response surface model

2.3.2.2各因子交互作用對乙偶姻產(chǎn)量影響的分析

響應(yīng)面法的圖形是特定的響應(yīng)值（Y）與對應(yīng)的因素A、B、C、D構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的曲面圖，每個響應(yīng)面對其中兩個因素進(jìn)行分析，另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用，并通過等高線圖得最優(yōu)條件下各試驗(yàn)因子的取值。對培養(yǎng)溫度（A）、接種量（B）、培養(yǎng)基初始pH值（C）、搖床轉(zhuǎn)速（D）4 個因素的兩兩交互作用分析，做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖。由培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH值的響應(yīng)面圖（圖3a）可知，響應(yīng)曲面坡度陡峭并且等高線扁而十分密集，說明C92菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT受到培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH值兩因素間交互作用的影響趨勢較明顯，而由培養(yǎng)基初始pH值與接種量的響應(yīng)面圖（圖3b）以及搖床轉(zhuǎn)速與接種量的響應(yīng)面圖（圖3c）可知，響應(yīng)曲面坡度陡峭度降低，等高線密集，說明C92菌株發(fā)酵產(chǎn)ACT受該兩因素間交互作用的影響，但趨勢度降低。該結(jié)果與表5的方差分析結(jié)果一致。由圖3d可知，實(shí)際值與預(yù)測值的擬合度較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

圖3　響應(yīng)面分析因素間交互作用對ACT產(chǎn)量的影響（a～cc）及實(shí)際值與預(yù)測值的擬合性（dd）Fig.3 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on ACT yield （a-c） and fitting of actual and predicted values （d）

2.3.2.3最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件產(chǎn)量及驗(yàn)證

通過對回歸模型進(jìn)行方差分析，得 到C92菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)ACT條件為：培養(yǎng)溫度31.31 ℃、接種量8.27%、培養(yǎng)基初始pH 6.55、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min，乙偶姻產(chǎn)量理論值為18.97 g/L。在此條件下，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，得到乙偶姻實(shí)際產(chǎn)量為19.04 g/L。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.36%。而且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。因此，該模型設(shè)計(jì)合理且結(jié)果有效，得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件可靠，可以為實(shí)際生產(chǎn)提供有效的指導(dǎo)。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從涼州熏醋醋醅中分離獲得200 株產(chǎn)酸微生物，通過V-P顯色反應(yīng)篩選出28 株可以產(chǎn)生乙偶姻的菌株，使用GC-FID定量檢測各菌株產(chǎn)乙偶姻的能力，并對高產(chǎn)菌株進(jìn)行生理生化及16S rRNA鑒定，確認(rèn)得到的該高產(chǎn)乙偶姻的菌株為巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化A. pasteurianus發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的條件。通過方差分析可知，實(shí)驗(yàn)中4 個因素對產(chǎn)物產(chǎn)量均有顯著影響，A. pasteurianus發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度31.31 ℃、接種量8.27%、培養(yǎng)基初始pH 6.55、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min，此條件下乙偶姻產(chǎn)量最大，達(dá)到19.04 g/L，比原始發(fā)酵產(chǎn)量高35.8%。因此，本實(shí)驗(yàn)分離篩選出的C92菌株具有提高涼州熏醋發(fā)酵風(fēng)味的潛在價(jià)值，在食醋生產(chǎn)過程中應(yīng)用前景廣闊。

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Isolation of Acetic Acid Bacterium with High Acetoin-Producing Ability from Aerobic Solid-Fermentation Culture of Liangzhou Fumigated Vinegar and Optimization of Its Fermentation Conditions

ZHAO Hongyuan， YUN Jianmin*， SHAO Xiaoqing， QI Dan
（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Acetoin （ACT） is the precursor of tetramethylpyrazine， a popular food flavor found in different traditional fermented foods. In our present study， we isolated approximately 200 pure cultures by forming transparent zone on GYC agar medium， and obtained 28 ACT-producing strains from these isolates by Voges-Prosk auer （V-P ） colorimetric assay and gas chromatograph with fl ame ionization detector （GC-FID）. Based on ACT level， C92 strain with the highest yield was selected for further analysis. It was identifi ed as Acetobacter pasteurianus by physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence similarity. We examined ACT level of C92 strain under different conditions and found that the optimal culture conditions that provided maximum ACT yield of 19.04 g/L were 31.31 ℃， pH 6.55， shaking at 209 r/min，48 h and inoculum size of 8.27%， representing a 35.8% increase compared to that before optimization. Therefore， C92 has a promising potential in the production of vinegar.

Liangzhou fumigated vinegar； Acetobacter pasteurianus； acetoin； response surface optimization

TS264.2

A

1002-6630（2015）15-0098-07

10.7506/spkx1002-6630-201515019

2014-11-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31360405）

趙洪源（1987—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵。E-mail：31593229@163.com

贠建民（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵與發(fā)酵工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn