李　恒，程敏姮，佘銳萍，朱日寧，李　威，王曉陽，張　洋，吳橋興，石蕊寒，胡鳳嬌

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京　100193）

豬繁殖與呼吸綜合征與大腸桿菌混合感染病例診斷報(bào)告

李恒，程敏姮，佘銳萍，朱日寧，李威，王曉陽，張洋，吳橋興，石蕊寒，胡鳳嬌

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

2014年3月，北京某規(guī)?；i場發(fā)病，病豬表現(xiàn)為呼吸困難、耳朵發(fā)紺、體溫升高、進(jìn)食減少、眼結(jié)膜發(fā)炎等臨床癥狀。通過組織病理學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)合病原學(xué)方法，對該豬場病死仔豬檢測分析。大體剖檢結(jié)果顯示肺臟干酪樣變，腎臟腫大，淋巴結(jié)呈黑紅色；組織病理學(xué)結(jié)果顯示仔豬肺臟嚴(yán)重出血，腸道大面積壞死。PCR檢測PRRSV和大腸桿菌陽性。綜合診斷該豬場混合感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒與致病性大腸桿菌，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的出血性肺炎和壞死性腸炎，引起仔豬死亡。

種豬；藍(lán)耳??；呼吸障礙；壞死性腸炎；致病性大腸桿菌；混合感染

2014年3月北京某規(guī)模化豬場發(fā)生大小育肥豬發(fā)病、仔豬病死情況。該豬群持續(xù)發(fā)病3天，死亡6頭。其主要癥狀表現(xiàn)為眼結(jié)膜潮紅、喘氣、呼吸困難、體溫升高、進(jìn)食減少、耳朵發(fā)紺、腹下皮膚呈紫色、有點(diǎn)狀出血、精神萎靡。根據(jù)臨床癥狀及大體剖檢診斷結(jié)果，我們推測該規(guī)?；i場可能感染PRRSV或者PCV2。本實(shí)驗(yàn)室通過組織病理學(xué)、分子生物學(xué)方法，對豬場發(fā)病豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1病料

患病仔豬2頭，來源于北京某規(guī)?；i場。

1.2剖檢取材

取內(nèi)臟器官于25mL/L 戊二醛-多聚甲醛混合液充分固定后，常規(guī)方法制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色。重點(diǎn)觀察心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脾臟和胃腸道的病理學(xué)變化，OLYMPUS 顯微鏡拍照。

1.3細(xì)菌學(xué)檢查

無菌條件下，采取病豬組織（肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟）分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取培養(yǎng)基上的菌落，純培養(yǎng)。

1.4細(xì)菌PCR檢測、測序

細(xì)菌純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落用16s RNA細(xì)菌通用引物［1］進(jìn)行PCR檢測，上游引物序列為gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列為ctahagggtatctaatcct，目的片段大小約為750 bp。

PCR體系：Taq酶12.5 μL，待檢模板1 μL，上下游引物各1 μL，滅菌水9.5 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.5病毒學(xué)檢查

根據(jù)病理組織學(xué)觀察，懷疑病豬可能是PCV2或 PRRSV感染。因此，我們采用PCV2和PRRSV 的引物對病死豬的肝臟、腎臟和肺臟組織進(jìn)行PCR檢測。PRRSV上游引物序列為CCAAATAACAACGGCAAGCA，下游引物序列為ATGCTGAGGGTGATGCTGTGA，目的片段大小332bp［2］。PCV2 ORF2上游引物序列為CACGGATATTGTAGTCCTGGT，下游引物序列為CCGCACCTTCGGATATACTGTC［3］。

PCR體系：Taq酶12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，滅菌水9.5 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司測序。

2　結(jié)果

2.1大體剖解觀察

病豬被毛粗糙，肝門周圍有分泌物附著，且有紫色瘀斑和血痂（圖1）。體表淋巴結(jié)呈磚紅色，部分淋巴結(jié)呈黑紅色，切面外翻（圖2）。腎臟腫大，邊緣鈍圓（圖3、4）。肺臟病變嚴(yán)重，可見肺臟呈現(xiàn)大面積的干酪樣變，觸摸質(zhì)地堅(jiān)實(shí)（圖5）；心壁柔軟，心腔內(nèi)有血凝塊（圖6）。

2.2組織病理學(xué)觀察結(jié)果

（1）肺臟：肺正常組織結(jié)構(gòu)被破壞，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞充滿整個(gè)肺組織（圖7）；支氣管細(xì)支氣管內(nèi)有炎性細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)還有纖維蛋白滲出（圖8）；肺臟血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主（圖9）。

（2）十二指腸：腸粘膜上皮壞死脫落，固有層裸露，水腫（圖10）。

（3）心臟：心外膜下有少量炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主 ；心肌纖維變性壞死，發(fā)生波浪樣變（圖11）。

（4）肝臟：肝臟淤血，小葉間間質(zhì)和匯管區(qū)周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，中央靜脈內(nèi)淤血，肝細(xì)胞腫脹，發(fā)生明顯的顆粒變性（圖12、13）。

圖1 紫色瘀斑和血痂　

圖2 黑紅色淋巴結(jié)

圖3 腎臟腫大

圖4腎臟切面外翻　

圖5 肺實(shí)變　

圖6 心腔內(nèi)血凝塊

圖7 肺臟正常結(jié)構(gòu)破壞 HE20X　

圖8 細(xì)支氣管內(nèi)蛋白樣滲出 HE20X

圖9血管擴(kuò)張充血 HE40X

圖10腸粘膜上皮壞死脫落HE10X　

圖11 心肌波浪樣變 HE20X

圖12 肝臟炎性細(xì)胞浸潤 HE40X

圖13 肝臟顆粒變性 HE40X　

圖14 脾臟白髓淋巴濾泡排空 HE40X　

圖15 淋巴結(jié)水腫，彌散性出血 HE40X

圖16 細(xì)菌16SRNA PCR檢測條帶

圖17　肝、肺、腎PRRSV PCR檢測條帶

（5）脾臟：脾臟的白髓區(qū)發(fā)生散在的淋巴細(xì)胞排空現(xiàn)象，局部出血（圖14）。

（6）淋巴結(jié)：全身各淋巴組織壞死嚴(yán)重，大量淋巴細(xì)胞排空，被膜下有大量含鐵血黃素沉著，小梁周隙增寬，淋巴結(jié)水腫，呈彌散性出血（圖15）。

2.3細(xì)菌PCR檢測結(jié)果

用細(xì)菌的通用引物16s rRNA，對培養(yǎng)出的細(xì)菌作PCR檢測，電泳結(jié)果如圖16。測序結(jié)果為大腸桿菌。與現(xiàn)有報(bào)道的致病性豬源大腸桿菌同源性高達(dá)100%（登錄號：KT388747）。

2.4病毒PCR檢測結(jié)果

PRRSV引物PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在肝、肺、腎的組織中均檢測到一條320 bp左右的陽性條帶（圖17），與PRRSV 預(yù)期擴(kuò)增片段相符。測序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行BLAST比對，與現(xiàn)有報(bào)道的PRRSV同源性高達(dá)99%。而用PCV2引物為模板未擴(kuò)增出陽性條帶。

2.5病毒基因進(jìn)化樹分析

將測得的該毒株ORF7基因序列和國內(nèi)外PRRSV毒株核苷酸序列利用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，測得該P(yáng)RRSV毒株為North American型 （圖18）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，該高致病性PRRSV與HUB-2株，HUN-4株遺傳關(guān)系較近，處于同一分支；與LV株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于不同基因型的PRRSV。

圖18 PRRSV毒株與參比毒株基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3　討論

病毒感染導(dǎo)致機(jī)體肝臟、腎臟受損，肺腫脹、變硬、干酪樣壞死，并以大葉性肺炎或出血性肺炎為特征［4］，給各地豬場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本病例中可見病豬肺臟結(jié)構(gòu)被破壞，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞充滿整個(gè)肺組織，肺泡堵塞，呼吸困難；全身各淋巴組織壞死嚴(yán)重，大量淋巴細(xì)胞排空，中性粒細(xì)胞浸潤，提示細(xì)菌感染［5］。通過PCR檢測結(jié)果顯示，我們在各器官內(nèi)均檢測到了豬繁殖與呼吸綜合征病毒和致病性大腸桿菌，病原菌的混合感染導(dǎo)致機(jī)體腸道粘膜受損，出現(xiàn)出血性肺炎和壞死性腸炎，是引起仔豬死亡的原因。

目前豬場中多數(shù)疫情均為混合感染，其中以高致病性繁殖與呼吸綜合征為主的重大疫病危害巨大［6］。因此，對PRRS這一疾病我們應(yīng)該高度重視，及時(shí)注射疫苗，做好相關(guān)生物安全防護(hù)工作，嚴(yán)格衛(wèi)生管理制度，做好豬場的衛(wèi)生消毒工作，嚴(yán)格阻斷病原微生物的感染與傳播。

4　結(jié)論

北京某規(guī)模化豬場仔豬發(fā)病，綜合流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理組織學(xué)觀察和病原學(xué)檢測，確定本次豬病為豬繁殖與呼吸綜合征病毒與致病性大腸桿菌混合感染，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的出血性肺炎和壞死性腸炎，引發(fā)仔豬死亡。混合感染病變嚴(yán)重，感染率高、死亡率高，所以應(yīng)引起集約化大規(guī)模養(yǎng)豬場管理者的高度重視，堅(jiān)持合理用藥，以保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

［1］ 萬志明，湯耀卿，韓天權(quán)，等. 細(xì)菌通用引物PCR快速診斷全身性感染的研究［J］. 外科理論與實(shí)踐，1998（2）： 84-87.

［2］ Mao J J，Zhao Y. One case of swine hepatitis E virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus coinfection in weaned pigs［J］. Virol J，2013，10（1）： 341.

［3］ Hamel A L，Lin L L，Sachvie C，et al. PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus. Can J Vet Res，2000，64（1）： 44-52.

［4］ 張妙紅. 豬高致病性藍(lán)耳病病理學(xué)研究［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［5］ 賈蓓，錢元恕. 中性粒細(xì)胞在細(xì)菌感染中的免疫調(diào)節(jié)作用［J］. 國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2004（2）： 61-63.

［6］ 石麗娟. 豬繁殖與呼吸障礙綜合征的防治［J］. 湖北畜牧獸醫(yī)，2015（2）： 21-23.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

A Diagnostic Report on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Escherichia coli Co-infection in Swine

Li Heng，Cheng Minheng，She Ruiping，Zhu Rining，Li Wei，Wang Xiaoyang，Zhang Yang，Wu Qiaoxing，Shi Ruihan，Hu Fengjiao
（College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193）

Large number of pigs in a pig farm of Beijing suffered from a disease in March 2014，manifested as dyspnea，skin cyanosis，hyperthermia，decreased appetite，conjunctiva inflammation and other clinic symptoms. Severe pathological changes were observed： pulmonary caseation，kidney enlargement and black and red lymph nodes. The histopathological findings included severe pulmonary hemorrhage and intestinal tractnecrosis. PCR was used to identify the pathogen. The results showed that these swine were infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and pathogenic Escherichia coli，resulting in hemorrhagic pneumonia and necrotic enteritis，finally causing pig deaths. Key words： swine；PRRS；pathogenic E. coli； respiratory disorder；necrotic enteritis；co-infection

S858.28

B

1005-944X（2015）11-0080-04

佘銳萍