楊套偉，饒志明，賈明媚，張顯，徐美娟

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

通過融合雙親短肽改善L-天冬酰胺酶酶學(xué)特性

楊套偉，饒志明*，賈明媚，張顯，徐美娟

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

L-天冬酰胺酶可以將L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸與氨，主要應(yīng)用在醫(yī)藥與食品行業(yè)。作者嘗試在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自組雙親短肽，改善該酶的酶學(xué)特性。首先，利用分子克隆技術(shù)將6條分別具有不同特征的短肽與L-天冬酰胺酶的N-端融合，并在Escherichia coli BL21中進(jìn)行表達(dá)，最后，利用Ni2+-NTA純化獲得純的重組L-天冬酰胺酶酶液。結(jié)果表明，融合SAP4對(duì)L-天冬酰氨酶（ansZ酶）動(dòng)力學(xué)特征影響較大，融合蛋白SAP4-ansZ的比活力較融合前提高約30%，其中重組蛋白Km值較原始酶下降了7.5%，而Vmax值得提升了10%，說明融合SAP4可以改善ansZ酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率。

L-天冬酰胺酶；雙親短肽；融合；酶學(xué)特征

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase amidohydrolase，E.C.3.5.1.1）能夠?qū)-天冬酰胺水解脫氨基形成L-天冬氨酸和氨［1］。1961年，Broome證明豚鼠血清可以有效抑制白血病細(xì)胞6C3HED［2］。目前，L-天冬酰胺酶已經(jīng)被制成藥劑，成為抗癌以及治療急性淋巴細(xì)胞白血病新藥之一，在日本以及歐美等國(guó)家均已有該商品酶出售［3］。另外，在食品加工前加入天冬酰胺酶可以有效降低丙烯酰胺含量。Kukurova等研究發(fā)現(xiàn)，在面粉高溫處理之前加入不同劑量的天冬酰胺酶，油炸食品中丙烯酰胺的含量較對(duì)照減少達(dá)90%，面粉中谷氨酸比未處理的樣品增加37%，而加工產(chǎn)品的顏色沒有明顯的變化［4］。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉凌等發(fā)現(xiàn)油炸膨化產(chǎn)生的丙烯酰胺含量比微波膨化多，加入一定劑量的L-天冬酰胺酶后，食品中95%以上的L-Asn都可以轉(zhuǎn)化成L-Asp，油炸膨化中丙烯酰胺含量可以減少45%，表明添加L-天冬酰胺酶可以從源頭上有效地抑制食品加工過程中丙烯酰胺的生成［5］。

從豚鼠血清中提取L-天冬酰胺酶，不但含量少，且提取工藝復(fù)雜；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-天冬酰胺酶具有周期短，提取成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，利用微生物法生產(chǎn)L-天冬酰胺酶研究較多的主要包括E.coli、E.carotovora以及E.chrysanthemi等，但是這些野生菌株酶活力較低，通過分子改造構(gòu)建高效合成L-天冬酰胺酶的重組菌是一個(gè)有效的手段之一。Sidoruk等通過將來源于Y.pseudotuberculosis Q66CJ2（YpA）的L-天冬酰胺酶在E.coli中異源表達(dá)，重組菌酶活可達(dá)到20 U/mL［6］。孫茂盛等將E.coli L-天冬酰胺酶II的β-轉(zhuǎn)角位置Asp178換成Pro，重組酶的熱穩(wěn)定性得到提高，半衰期溫度（T16/02min）由原58℃提高至63℃，而對(duì)酶催化活力以及米氏常數(shù)Km和Kcat無影響［7］。

通過化學(xué)或分子修飾能夠有效改善酶的特征［8-9］。自組雙親短肽（Self-assemblingamphipathic peptides，SAP）是由相互交替的親水性和疏水性氨基酸形成，能夠聚集形成有序的納米結(jié)構(gòu)［10］。因此，SAP主要應(yīng)用于納米技術(shù)領(lǐng)域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SAP可以用于改善酶學(xué)特性：例如利用這些短肽形成的氫化作用來固定化酶以提高酶活和穩(wěn)定性［10］，通過融合雙親短肽提高脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性和比酶活［11］，融合雙親短肽同樣可以提高堿性淀粉酶的催化效率、熱穩(wěn)定性以及抗氧化性［12］，而融合雙親短肽對(duì)于對(duì)L-天冬酰胺酶還未見報(bào)道。

1　材料與方法

1.1多肽序列

連有6種不同的自組雙親短肽（SAP）的重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAPs由江南大學(xué)劉龍教授惠贈(zèng)，6個(gè)不同序列的多肽特征見表1［13］。位于短肽SAP的C端和ansZ N端之間有一段序列為PTPPTTPTPPTTPTPT的連接臂（PT linker），SAP、PT linker和ansZ基因連接至表達(dá)載體pET-22b（+）。

表1　多肽序列及特征Table 1 Sequences and characterisitics of the peptides

1.2N端融合多肽菌株的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAP-ansZ的構(gòu)建過程如下：首先以實(shí)驗(yàn)室保藏pMD18-T-ansZ［14］為模板擴(kuò)增ansZ基因。引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物：GACCCATGGATATGAAAAAACA ACGAATGC（Nco I）

下游引物：GACCTCGAGTTAATACTCATTGAA ATAAG（Xho I）

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后分別連接于同樣酶切的pET-22b（+）/SAP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAP-ansZ，重組表達(dá)載體通過CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli，獲得重組菌E.coli/pET-22b（+）/SAP-ansZ，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，采用甘油法保藏。

1.3重組酶的純化

按照E.coli培養(yǎng)方法，發(fā)酵結(jié)束后，4℃、8 000 g離心10 min，棄上清液，收集菌體并用PBS緩沖液洗滌2次，超聲波破碎菌體，4℃、10 000 g離心30 min，收集上清液并用0.45μm無機(jī)濾膜過濾。過濾液采用Ni2+-NTA純化，上樣至已用McAc-0溶液平衡的Ni2+親和吸附柱，用McAc-0洗去雜蛋白，目的蛋白采用0～1.0 mol/L的咪唑溶液進(jìn)行線性梯度洗脫洗脫，收集最大吸收峰處的洗脫液，用于SDSPAGE分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.4酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1重組酶的分離純化

1）硫酸銨分級(jí)沉淀：重組菌B.subtilis 168/ pMA5-ansZ于最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，于4℃、8 000 g離心10 min，收集上清液，低溫條件下向上清液中添加研碎的（NH4）2SO4粉末至6個(gè)不同飽和度（30%～80%），0℃靜置，4℃、10 000 g離心30 min，收集上清液，沉淀用含有1.5 mol/L（NH4）2SO4的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）溶解，分別測(cè)定上清液與沉淀的酶活。

2）疏水層析：重新溶解的沉淀采用0.45μm無機(jī)濾膜過濾，過濾液上樣至Butyl Sepharose HP層析柱，用含1.5 mol/L（NH4）2SO4的Tris-HCl緩沖液清洗雜蛋白至基線平衡，目的蛋白用0～1.5mol/L的（NH4）2SO4緩沖液線性梯度洗脫，流速為1.0mL/min，收集目標(biāo)蛋白，透析袋透析去除鹽離子，透析后的蛋白用于SDS-PAGE分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.4.2重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1）Asn的最適反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度：將純酶液分別加入到不同pH緩沖液中（pH 3.0～6.5，0.05 mol/L citrate-sodium citrate buffer；pH 6.5～9.0，0.05 mol/L Tris-HCl buffer；pH 9.0～10.0，0.05 mol/L borax-sodium hydroxide buffer），于37℃反應(yīng)15 min，氨氣敏電極測(cè)定酶活，考察不同pH緩沖液對(duì)天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得重組酶的最適反應(yīng)pH。在最優(yōu)pH條件下，將純酶液添加到反應(yīng)體系中，將反應(yīng)體系分別置于20～70℃（每隔5℃為一個(gè)梯度）反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，分析不同反應(yīng)溫度對(duì)天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得此酶的最適反應(yīng)溫度。

2）Asn的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性：將該酶放置于不同pH緩沖液中，0℃保溫24 h，每隔一段時(shí)間取樣，測(cè)定酶活，考察ansZ在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性。將純酶液分別在-20、0、20、30、40、50、60℃放置10 h，每隔一段時(shí)間取樣，于最適反應(yīng)pH和溫度下反應(yīng)15 min，測(cè)定酶活，考察ansZ在不同溫度下的穩(wěn)定性。

3）Asn反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值和Vmax：配制不同濃度的L-Asn和L-Gln緩沖液，加入過量的純酶液，反應(yīng)體系置于最適條件下反應(yīng)，通過氨氣敏電極測(cè)定產(chǎn)物氨的增加量，通過Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算獲得Km值和Vmax。

1.5Asn的結(jié)構(gòu)模擬和分析

Asn的結(jié)構(gòu)采用EasyModeller2.0軟件模擬，以L-天冬酰胺酶1hg0B為模板，模擬出的3-D結(jié)構(gòu)采用Discovery studio 2.5軟件進(jìn)行分析。

1.6Asn酶活測(cè)定

酶活測(cè)定采用氨電極法，氨電極可以測(cè)定溶液中的溶解氨［15-16］。檢測(cè)設(shè)備包括連接至數(shù)顯pH計(jì)的氨氣敏電極和磁力攪拌器。25 mL反應(yīng)體系：10 mL、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，10 mL、0.05 mol/L L-Asn，加入0.5～1.0 mL的酶液，37℃水浴反應(yīng)15 min，加入5 mL、15%三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照管在水浴反應(yīng)之前加入5 mL、15%三氯乙酸。氨電極采用不同濃度的NH4Cl溶液校正并獲得銨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活單位：按照以上條件，單位體積酶催化L-天冬酰胺產(chǎn)生1μmol/L的氨所消耗的酶量為1個(gè)酶活單位。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法測(cè)定［17］。

1.7Asn酶純化指標(biāo)的計(jì)算

總活力=活力單位數(shù)/mL酶液×總體積（mL）

比活力（U/mg蛋白質(zhì)）=活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)=總活力單位數(shù)/mg總蛋白質(zhì)

純化倍數(shù)=第一次的比活力/每次的比活力

回收率（%）=第一次總活力/每次總活力×100%

2　結(jié)果與討論

2.1重組菌E.coli BL21/pET-22b（+）-SAP-ansZ的構(gòu)建

將表1所述的6條SAP分別與ansZ的N端接，多肽與ansZ之間采用PT linker連接。重組載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21，通過Amp抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖1。由圖1可知，6條多肽菌連接至載體pET-22b（+），經(jīng)過Xho I和Nco I雙酶切后獲得1.1 kb和5.7 kb左右大小的線性化基因片段。

圖1　多肽融合重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖Fig.1　Identification of the recombinant plasm ids by enzyme d igestion

2.2重組蛋白的表達(dá)與純化

按照2.3方法，采用Ni2+-NTA進(jìn)行純化，獲得純酶液，對(duì)純酶液進(jìn)行酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析，融合蛋白的純化結(jié)果見表2。以不融合多肽的重組蛋白Asn作為對(duì)照，融合SAP5和SAP6，重組酶的比活力較對(duì)照有所下降，SAP6下降最明顯。融合SAP1對(duì)比酶活基本沒有影響，融合SAP2、SAP3和SAP4，重組蛋白的比酶活菌有所提高，其中SAP4-ansZ比酶活是對(duì)照的1.3倍。

純化蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2，由電泳結(jié)果可知，經(jīng)過Ni2+-NTA純化后，獲得單一的條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小約為38 000左右。

圖2　融合蛋白純化后SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of the purified fusion proteins

表2　融合蛋白的純化結(jié)果Table 2 Purification of the fusion proteins

2.3重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1重組蛋白的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性從圖3（a）可知，融合SAP1、SAP2、SAP5和SAP6的重組酶的最適pH沒有產(chǎn)生變化，最適pH值7.5，與不融合多肽的重組蛋白Asn相似，融合SAP3和SAP4的重組蛋白最適pH由7.5上升至8.0。由3（b）可知，融合多肽后，重組酶的pH穩(wěn)定性改變不明顯，融合蛋白穩(wěn)定性范圍與Asn較一致。

圖3　融合蛋白的最適pH（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.3　Effects of pH（a）and pH stability on the fusion p roteins（b）

2.3.2重組蛋白的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性由圖4（a）可知，融合蛋白的最適反應(yīng)溫度為37～40℃。融合SAP4和SAP5的重組酶最適反應(yīng)溫度與對(duì)照ansZ一致，均為40℃，融合SAP1、SAP2、SAP3和SAP6最適反應(yīng)溫度稍微下降，由40℃變?yōu)?7℃。圖4（b）為融合蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果。融合多肽后，重組酶的熱穩(wěn)定性較對(duì)照僅發(fā)生細(xì)微的變化，熱穩(wěn)定性范圍與對(duì)照較相似。

圖4　融合蛋白的最適溫度（a）及熱穩(wěn)定性（b）Fig.4　Effects of tem perature（a）and thermal stability on the fusion proteins（b）

2.3.3重組蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法求得融合蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見表3。從表3可知，融合SAP1、SAP2、SAP3、SAP4和SAP6重組蛋白的米氏常數(shù)Km均下降，其中融合SAP1變化最大，Km值由0.68mmol/L下降為0.49 mmol/L，而融合SAP5酶的Km值有所上升，其Km值為0.75 mmol/L。只有融合SAP2和SAP4的重組蛋白最大反應(yīng)速率Vmax較對(duì)照有所增大，其中融合SAP4 Vmax由60.24μmol/（L·min）上升至66.22μmol/（L·min），其他多肽的融合均導(dǎo)致Vmax不同程度下降，SAP3下降最明顯，Vmax值僅為25.25 μmol/（L·min）。因此，融合SAP4對(duì)Asn酶動(dòng)力學(xué)特征影響較大，其中重組蛋白Km值較原始酶下降了7.5%，而Vmax值得提升了10%，說明融合SAP4可以改善ansZ酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率。

表3　融合蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 3 Kinetic parameters of the fusion proteins

2.4重組蛋白結(jié)構(gòu)模擬與分析

由酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合SAP4的重組酶比活力較對(duì)照獲得提高，酶的催化效率獲得一定程度提高，底物親和力也有所提高。采用計(jì)算機(jī)模擬獲得了原始酶Asn和重組酶SAP4-ansZ的結(jié)構(gòu)，和其他已報(bào)道結(jié)構(gòu)的L-天冬酰胺酶一樣，該酶是一個(gè)四聚體復(fù)合物，含有四個(gè)亞基［18］，每個(gè)亞基含有14個(gè)β折疊和8個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。為了便于觀察，我們將連接多肽的亞基結(jié)構(gòu)單獨(dú)顯示出來，見圖5，并探討短肽的加入對(duì)其活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的影響。L-天冬酰胺酶N端的活性位點(diǎn)包括Thr 36、Ser 84、Glu 87、Thr 109、Asp 112和Ala 148，除了Ser 84和Glu 87位點(diǎn)外，其它氨基酸殘基都是非常保守的［18-19］。在催化反應(yīng)過程中親核試劑主要為Thr殘基，酶活性中心的Thr殘基上的羥基親核攻擊底物β-羰基上的C原子，形成四面體中間構(gòu)型［18］。

圖5　Asn（a）和SAP4-ansZ（b）的3-D結(jié)構(gòu)Fig.5 3-D structure of Asn（a）and SAP4-ansZ（b）

圖6為酶的活性位點(diǎn)分析結(jié)果，SAP4-ansZ的活性位點(diǎn)與Asn相比較，構(gòu)象有細(xì)微的改變，而且融合后活性位點(diǎn)周圍的氫鍵數(shù)及鹽離子鍵也減少，氫鍵和離子鍵的減少會(huì)使活性位點(diǎn)之間的催化殘基變得更靈活。因此，氫鍵和離子鍵的改變可能會(huì)使酶的催化效率及對(duì)底物親和力提高［20］。

圖6　Asn（a）和SAP4-ansZ（b）的活性位點(diǎn)分析Fig.6 Analysis of the active site of Asn（a）and SAP4-ansZ（b）

3　結(jié)語

作者通過融合SAP4雙系短肽改善L-天冬酰氨酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率，而對(duì)該酶其它特征影響并不明顯。另外，該方法對(duì)于改善其它酶的特征提供了借鑒。

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Improvement of Characteristic of L-Asparaginase through Fusing Six Self-Assembling Amphipathic Peptides to Its N-Terminal

YANG Taowei，RAO Zhiming*，JIA Mingmei，ZHANG Xian，XU Meijuan
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

L-asparaginase（Asn）can catalyzes the hydrolysisof L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia.It ismainly applied in pharmaceutical and food industry.In this study，to improve the characteristic of Asn，we fused six self-assembling amphipathic peptides（SAPs）to its N-term inal and expressed the recombinant Asns in E.coli，respectively.Compared to w ide-type Asn，the SAP4-Asn activity increased by 30%，the value of Kmdecreased by 7.5%and the Vmaxincreased by 10%.The reaction kinetics analysis showed that the affinity ability and catalytic efficiency of the fusion enzyme towards L-asparagine improved compared to wide-type Asn.

L-asparaginase，self-assembling amphipathic peptides，fusion，characterization

Q 55

A

1673—1689（2015）11—1178—07

2014-05-20

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2015AA021004）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400082）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP11545）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；111引智計(jì)劃（111-2-06）項(xiàng)目；江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目。

楊套偉（1983—），男，河南漯河人，工學(xué)博士，講師，主要從事代謝工程、酶工程方面的研究。E-mail：ytw1228@163.com

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事代謝工程、發(fā)酵工程方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn