王宇豪　趙冬香　王玉潔　劉俊峰　高景林　劉桂瓊

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?71101；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070）

中華蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶最佳反應(yīng)體系的建立

王宇豪1，2趙冬香1王玉潔1劉俊峰1高景林1劉桂瓊2

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?71101；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070）

乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的生化標(biāo)記物，利用其活性的變化可以監(jiān)測農(nóng)藥對昆蟲的亞致死效應(yīng)。乙酰膽堿酯酶活性測定的條件會因?yàn)閬碓从诓煌奈锓N甚至同一物種不同部位而改變。本文采用正交試驗(yàn)排列的25個組合試驗(yàn)探究了酶濃度、底物濃度、pH、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間5個因素對測定中華蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶比活力的影響，并從中選擇出最佳測定組合。試驗(yàn)結(jié)果表明，5個因素對中華蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶比活力影響的大小順序?yàn)槊笣舛龋痉磻?yīng)溫度＞pH＞反應(yīng)時間＞底物濃度，各因素最佳組合為酶濃度0.25g/L、底物濃度0.8mmol/L、pH值7.5、反應(yīng)溫度40℃及反應(yīng)時間5min。本文優(yōu)化了中華蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶測定條件，為今后評估有機(jī)磷類、氨基甲酸類和新煙堿類殺蟲劑提供條件。

中華蜜蜂；乙酰膽堿酯酶；正交試驗(yàn)；最佳測定條件

蜜蜂作為具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的社會性昆蟲［1］，在維系物種多樣性和農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有不可替代的作用。全球約87.5%的顯花植物需要昆蟲傳粉，而蜜蜂約占傳粉昆蟲總數(shù)的80%，人工飼養(yǎng)和野生存在的蜜蜂都在傳粉方面有著重要的作用［2-4］。我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的廣泛使用對蜜蜂的安全造成了嚴(yán)重的威脅，保護(hù)蜜蜂的相關(guān)工作刻不容緩。

中華蜜蜂Apis cerana cerana，簡稱中蜂，其具有嗅覺靈敏，抗螨、抗巢蟲能力強(qiáng)，善于利用零星分散的蜜粉源，抗寒耐熱，消耗飼料少等特點(diǎn)［5-7］。研究表明，與意大利蜜蜂相比，中華蜜蜂對藥劑更敏感，一些對意大利蜜蜂低毒的藥劑，可能會造成中華蜜蜂的大量中毒死亡［8］，因此有必要開展農(nóng)藥對中華蜜蜂影響相關(guān)研究。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase,AChE）是用來檢測生態(tài)環(huán)境中農(nóng)藥存在情況的幾種生物化學(xué)標(biāo)記酶之一，是有機(jī)磷和氨基甲酸類農(nóng)藥的靶標(biāo)酶。在小熊熊蜂［9］、中華蜜蜂和意大利蜜蜂［10,11］及其他多種生物［12-15］中均有研究報(bào)道。新煙堿類農(nóng)藥作為有機(jī)磷和氨基甲酸類農(nóng)藥的新一代神經(jīng)毒劑替代品，其也能對乙酰膽堿酯酶的活性產(chǎn)生影響［11,16,17］。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對多個影響中華蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶活性測定的因素進(jìn)行研究，并找出最佳測定組合，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1供試蜂群

中華蜜蜂（以下簡稱中蜂）采集蜂，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)所試驗(yàn)蜂場提供（N 19°32′, E 109°32′）。供試蜜蜂要求取自同一蜂群，身體狀況良好、飼喂?fàn)顩r一致。

1.2儀器設(shè)備與試劑

電子天平（XS 365M-SCS），瑞士Precisa公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2450），日本SHIMADZU公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（5810R），德國Eppendorf公司產(chǎn)品；循環(huán)水浴鍋（9012），美國Poly Science公司產(chǎn)品。

考馬斯亮藍(lán)G-250為Solarbio公司產(chǎn)品；5,5'-二硫雙硝基苯甲酸（5,5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, DTNB）與碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide, ATCI）為Xiya Reagent公司產(chǎn)品；牛血清蛋白、無水乙醇、95%乙醇、磷酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.3酶液制備

每次取6頭中蜂，低溫麻醉后，將其頭部剪下，放入1.5mL離心管中，加入液氮迅速用研磨棒磨成粉末，加入預(yù)冷的不同pH的0.1mol/L的磷酸緩沖液（0.1% Triton X-100）稍加勻漿，15000g離心20min，取上清液作為酶源。

1.4乙酰膽堿酯酶（AChE）活性測定

采用Gorun［18］改進(jìn)的Ellman方法測定乙酰膽堿酯酶活性。取待測酶液0.2mL與0.2mL ATCI混勻，不同處理按照正交組合中的不同要求分別進(jìn)行不同時間的反應(yīng)后，加入1.8mL顯色劑（DTNB）并終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測定OD412，重復(fù)3次。

其中：△OD=OD/反應(yīng)時間（單位為min），V為反應(yīng)總體積（單位為mL），ε為產(chǎn)物與DTNB絡(luò)合物的摩爾消光系數(shù)=13600L/mol·cm，L為比色杯的光程1 cm，mg為酶液中蛋白質(zhì)含量。

1.5蛋白質(zhì)含量的測定

參照Bradford［19］考馬斯亮藍(lán)G-250法。用牛血清白蛋白（BSA）測定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL待測粗酶液（調(diào)整蛋白質(zhì)含量在20～100μg范圍內(nèi)），加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液，混勻后2min～1h內(nèi)測OD595值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗酶液中蛋白質(zhì)的含量。

1.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)張瑩等［10］試驗(yàn)方法進(jìn)行酶促反應(yīng)正交試驗(yàn)，主要影響因素包括酶濃度、底物濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及反應(yīng)體系的pH（表1），采用的正交表為L25（56）。

表1　正交試驗(yàn)中的影響因素及水平

1.7統(tǒng)計(jì)方法

將測得25組吸光值用Excel處理，算出每組比活力。

運(yùn)用SPSS 19.0軟件，對25組數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析、方差分析、各水平間差異顯著性檢驗(yàn)。極差分析法初步確定5因素對乙酰膽堿酯酶比活力影響大小的順序及各因素中最優(yōu)水平，F(xiàn)檢驗(yàn)可以用于驗(yàn)證極差分析法得出的結(jié)論。若由于F檢驗(yàn)同一因素不同水平間呈極顯著關(guān)系，可以進(jìn)行各水平間差異顯著性檢驗(yàn)（SSR檢驗(yàn)）。

2　結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果的極差大小，表明了不同因素不同水平試驗(yàn)條件對試驗(yàn)結(jié)果的影響（表2）。

表2　不同正交處理組合下中蜂頭部AChE的比活力值

表3是對表2進(jìn)行極差分析得出的結(jié)果，顯示各因素對中蜂頭部AChE比活力的影響大小順序?yàn)椋好笣舛龋痉磻?yīng)溫度＞pH＞反應(yīng)時間＞底物濃度。酶濃度極差最大，則表示酶濃度對中蜂頭部AChE比活力的影響最大。從表3計(jì)算出的ki結(jié)果也能很直觀得出各影響因素的最優(yōu)水平。A因素最優(yōu)水平是1，即酶濃度為0.25g/L；B因素最優(yōu)水平是3，即底物濃度為0.8 mmol/ L；C因素最優(yōu)水平是4，即反應(yīng)體系pH為7.5；D因素最優(yōu)水平是4，即反應(yīng)溫度為40℃；E因素最優(yōu)水平是1，即反應(yīng)時間為5 min。

將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)。結(jié)果表明，5個因素對中蜂AChE比活力的測定結(jié)果的差異均達(dá)到極顯著水平。F值的大小也表明了5個因素對中蜂AChE比活力影響大小順序，其結(jié)果與極差分析法結(jié)果相一致（表3和表4）。

表3　正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

F檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5個因素對中蜂AChE比活力測定的差異均達(dá)到極顯著水平（表4），需要進(jìn)行因素內(nèi)5個不同水平之間的差異性檢驗(yàn)，由此選出測定中蜂AChE比活力的最優(yōu)組合條件水平。Duncan法（新復(fù)極差法）測定表明，各因素條件下，酶濃度的第一水平、底物濃度的第三水平、pH的第四水平、反應(yīng)溫度的第四水平及反應(yīng)時間的第一水平顯著高于其他各個水平，與極差分析法結(jié)果一致（表5）。

表4　L25（56）正交試驗(yàn)方差分析表

表5　正交試驗(yàn)5個影響因素各水平差異顯著性檢驗(yàn)（SSR檢驗(yàn)）

可見，5個因素對中蜂頭部AChE比活力都有顯著的影響，因此在測定中蜂頭部AChE比活力的時候需要對這5種因素進(jìn)行嚴(yán)格的控制。試驗(yàn)結(jié)果表明，測定中蜂頭部AChE比活力最佳條件組合為酶濃度0.25g/ L、底物濃度0.8mmol/L、pH值7.5、反應(yīng)溫度40℃及反應(yīng)時間5min。

3　討論

乙酰膽堿酯酶活性測定的條件會因?yàn)閬碓从诓煌奈锓N甚至同一物種不同部位而改變。研究表明，酯酶測定條件通常在最適pH、底物濃度及反應(yīng)溫度上有所改變［20］。眾所周知，酶濃度對于酶活性也有一定程度的影響，而隨著時間的推移、反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，底物濃度有所改變，酶活性也會有變化，所以反應(yīng)時間與酶的比活力值間有重要相關(guān)性。因此，有必要在測定中蜂頭部AChE比活力之前，針對酶濃度、底物濃度、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間5個因素進(jìn)行試驗(yàn)，確定最適中蜂頭部AChE比活力測定的條件。

當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中的底物濃度足夠大時，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，但在保證試驗(yàn)結(jié)果可信的前提下，應(yīng)盡量減少試驗(yàn)材料（蜜蜂頭部）的使用量，且比活力的計(jì)算與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)，合適的蛋白質(zhì)濃度對試驗(yàn)結(jié)果也有很大的影響。一般的酶，在酶濃度一定的情況下，酶促反應(yīng)速率會隨著底物濃度的增加而增加，直至趨于一個穩(wěn)定的最大速率，但過量的底物濃度會抑制AChE活性［21］。pH對酶促反應(yīng)的影響，從圖形上來看，通常為一鐘形曲線，即pH過高或者過低均會導(dǎo)致酶蛋白變性降低甚至失去活性，且如果pH高于8.0，用于試驗(yàn)的顯色劑DTNB會發(fā)生水解，影響試驗(yàn)結(jié)果［20］。酶促反應(yīng)依賴于溫度，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速率會極速增加，但若高于某一溫度時會導(dǎo)致酶蛋白變性降低活性或失活，最適溫度即為平衡點(diǎn)。不同的酶或不同物種不同組織來源的酶，最適溫度會有所不一樣。反應(yīng)時間與酶比活力的線性關(guān)系只在一定范圍內(nèi)成立，隨著反應(yīng)的推移，酶比活力會下降。

國內(nèi)外學(xué)者已對多種物種AChE測定條件做過研究。如星豹蛛Pardosa astrigera［22］、美洲蟑螂Periplaneta Americana［15］、鯽魚Carassius auratus［23］、黑翅土白蟻Odontotermes formosanus［13］、花翅搖蚊Chironomus kiiensis［12］、小峰熊蜂Bombus hypocrite［9］、意大利蜜蜂A.mellifera ligustica［10］等物種特定部位AChE活性測定條件已有研究。不同物種不同組織AChE活性的測定條件各異，但蜜蜂種屬的測定條件基本一致。

乙酰膽堿酯酶是用來檢測生態(tài)環(huán)境中污染物存在情況的幾種生物化學(xué)標(biāo)記酶之一，在檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中有著廣泛的運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了在海南地區(qū)利用中蜂測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥毒性依據(jù)的同時，下一步研究將會利用中蜂頭部乙酰膽堿酯酶對新煙堿類殺蟲劑進(jìn)行相關(guān)方面的研究。

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Establishment of optimization of assaying activity of head acetylcholinesterase from Apis cerana cerana

Wang Yuhao1，2Zhao Dongxiang1Wang Yujie1Liu Junfeng1Gao Jinglin1Liu Guiqiong2
（1 Environment and Plant Protection Research Institute,CATAS,Hainan Haikou 571101,China；2 College of Animal Science and Technology,Huazhong Agriculture University,Wuhan 430070,China）

Acetylcholinesterase is an important biochemical marker in insects,and its changes are usually used to monitor pesticide sublethal effects of insects.The conditions of acetylcholinesterase activity will change with different species or different parts of the same species In this paper,we identified the enzyme concentration,substrate concentration,pH,reaction temperature and reaction time by 25 combinations of orthogonal experiment.The five factors influence the specific activity of the head acetylcholinesterase of the Apis cerana cerana.The results showed that the order of the activity of acetylcholinesterase followed as concentration of protein＞temperature＞pH＞time＞concentration of substrate.And the optimal conditions were listed,such as enzyme concentration 0.25g protein/L, substrate concentration 0.8 mmol/L,pH 7.5,reaction temperature 40℃and reaction time 5 min.Above all,we optimized the conditions of A.cerana cerana head acetylcholinesterase,which will be helpful to the assessment of organophosphorus,carbamate and neonicotinoid insecticides.

Apis cerana cerana；Acetylcholinesterase；orthogonal experiment；optimal assay conditions

國家蜂產(chǎn)業(yè)體系儋州綜合實(shí)驗(yàn)站建設(shè)項(xiàng)目（No.CARSSYZ-14）；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)（No.ZDXM2014050）；公益性行業(yè)（蜜蜂）科研專項(xiàng)子課題（No.201203080-8）

王宇豪（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯涠纠韺W(xué)，E-mail:wang_yuh@163.com

高景林，E-mail:jinglin.g@163.com；劉桂瓊，gnrh@qq.com