烏日娜，徐　鑫，王茜茜，宋雪飛，薛雅婷，唐筱揚(yáng)，武俊瑞，*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)　110866；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫　214122）

植物乳桿菌在不同鹽質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中期全蛋白SDS-PAGE分析

烏日娜1，2，徐鑫1，王茜茜1，宋雪飛1，薛雅婷1，唐筱揚(yáng)1，武俊瑞1，*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110866；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

以耐鹽植物乳桿菌FS5-5為研究對(duì)象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)構(gòu)建了菌株在NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中期的全蛋白表達(dá)圖譜。通過(guò)比較分析，選取了6 個(gè)差異蛋白質(zhì)條帶，并采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)差異蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果表明：1號(hào)樣品條帶鑒定得到6 種蛋白；2號(hào)樣品條帶鑒定得到11 種蛋白；3號(hào)樣品條帶鑒定得到9 種蛋白；4號(hào)樣品條帶鑒定得到4 種蛋白；5號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白；6號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白。去除相同的蛋白，共有45 種蛋白得到鑒定。這些蛋白大致可以分為4 類：與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白25 種；與代謝相關(guān)的蛋白10 種；與核苷酸合成有關(guān)的蛋白8 種；未知功能蛋白2 種。可能由于這些蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，才導(dǎo)致菌體中蛋白質(zhì)合成、能量代謝、DNA復(fù)制能夠正常進(jìn)行，最終使植物乳桿菌FS5-5能夠更好地在鹽環(huán)境下生存下去。

植物乳桿菌FS5-5；鹽脅迫；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；差異蛋白

1994年，Marc Wikins等首次提出蛋白質(zhì)組這一概念，用來(lái)描述在特定時(shí)期或特定狀態(tài)下，一種生物體的某一組織或某一細(xì)胞的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)［1］。研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式的學(xué)科即為蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）［2］。隨著人們認(rèn)識(shí)到人類基因組計(jì)劃不能為治療疾病提供理想的切入點(diǎn)后，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)越來(lái)越受到人們的重視。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，常見(jiàn)于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中。最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，兼性厭氧，最適pH 6.5左右。菌體呈短桿狀，有時(shí)成對(duì)或成鏈狀，不產(chǎn)芽孢［3］。在食品工業(yè)生產(chǎn)中，常常會(huì)利用植物乳桿菌作為發(fā)酵劑來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵型食品。在發(fā)酵型食品的生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到外界鹽質(zhì)量濃度較高的環(huán)境。在這種環(huán)境中，菌株為了生長(zhǎng)繁殖會(huì)激發(fā)自身的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)來(lái)自外界鹽環(huán)境的脅迫［4］。對(duì)植物乳桿菌鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，有助于人們了解其鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，進(jìn)而為闡明植物乳桿菌鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

目前，研究者的研究目標(biāo)主要集中在乳酸菌的酸脅迫、堿脅迫、膽鹽脅迫過(guò)程中蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，而關(guān)于乳酸菌在鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)變化研究甚少。研究表明，乳桿菌在不同外界環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的表達(dá)有所不同。Wu Rina等［5］研究了益生菌Lactobacillus casei Zhang在酸脅迫下的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)在pH 2.5和pH 6.4時(shí)，有33 個(gè)蛋白位點(diǎn)發(fā)生改變。Johanna等［6］研究了酸脅迫對(duì)Lactobacillus rhamnosus GG蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化的影響，結(jié)果表明參與中樞細(xì)胞通路的蛋白質(zhì)被磷酸化，并且其中糖酵解酶被磷酸化最為廣泛。Lee等［7］研究了Lactobacillus johnsonii PF01在膽鹽脅迫下蛋白質(zhì)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大約215 個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生改變，這其中有94 種蛋白質(zhì)含量降低，121 種蛋白質(zhì)含量增加。Belfiore等［8］對(duì)Lactobacillus sakei CRL1756在NaCl環(huán)境下的基礎(chǔ)適應(yīng)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在鹽環(huán)境下菌體自身會(huì)生成應(yīng)激蛋白Hsp20、ClpB、Chaperone GrpE、ClpL ATPase protein、Chaperone DnaK，同時(shí)蛋白質(zhì)Fba、Pgk、Gpm5、Tpi的表達(dá)量降低。Zhao Shanshan等［9］研究結(jié)果表明Glycine betaine（GB）可以調(diào)節(jié)碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、保護(hù)核糖體的結(jié)構(gòu)，對(duì)Lactobacillus plantarum ST-III應(yīng)對(duì)鹽脅迫起到了非常重要的作用。當(dāng)用NaCl作為外界脅迫因素時(shí)，細(xì)胞外的滲透壓會(huì)增大，Li Chun等［10］發(fā)現(xiàn)GB具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓的作用。Leontiev等［11］發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，菌體Transport ATPase的表達(dá)量會(huì)增加，可以逆向運(yùn)輸將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的Na+運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，從而使乳酸菌能夠更好地生存下去。

本實(shí)驗(yàn)以耐鹽植物乳桿菌FS5-5為研究對(duì)象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）技術(shù)構(gòu)建該菌株在NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中期的蛋白質(zhì)圖譜，并對(duì)圖譜進(jìn)行比較分析，找出差異蛋白，以期為揭示植物乳桿菌FS5-5耐鹽分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株、培養(yǎng)基與試劑

菌種：3 株耐鹽性較好的植物乳桿菌，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、牛肉浸膏8 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、蛋白胨8 g/L、吐溫-80 1 g/L、酵母粉4 g/L、檸檬酸鈉2 g/L、三水乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

丙烯酸胺、Tris、SDS、四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）、N，N-甲叉雙丙烯酞胺、三氯乙酸美國(guó)Sigma公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、3-（（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基）-1-丙磺酸（3-（（3-cholamidopropyl）dimethylammonio） propanesulfonate，CHAPS） 美國(guó)Bio-Rad公司；過(guò)硫酸銨、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、3-（N-嗎啉）丙磺酸 （3-（N-morpholino） propanesulfonic acid，MOPS）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；NP-9080型生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋上海精宏試驗(yàn)儀器有限公司；VS-1型渦旋儀上海瀘西分析儀器廠有限公司；DW-86L486型超低溫保存箱青島海爾特種電器有限公司；Bio-Rad Mini、PROTEAN II XL Cell垂直電泳系統(tǒng)、Image Lab圖像分析系統(tǒng)、電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；低溫冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1耐鹽植物乳桿菌的培養(yǎng)

將采用真空冷凍干燥法凍干保存的3 株植物乳桿菌菌種［12］，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化3 代。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確定為純菌后，取第3代MRS液體培養(yǎng)物，12 000×g離心10 min，棄掉上清液，在沉淀中加入5 mL滅菌生理鹽水，12 000×g、10 min、4 ℃離心洗滌菌體，重復(fù)離心洗滌菌體2 次。最后加入5 mL滅菌生理鹽水，用渦旋儀振蕩混勻，即為供試菌液。

1.3.2耐鹽性菌株挑選

吸取混勻后的3 代菌液100 .L分別加入5 mL NaCl質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10、14、16、20 g/100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液用渦旋儀混勻后，以空白MRS液體培養(yǎng)基調(diào)零，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，挑選出一株耐鹽性最好的菌株。

1.3.3耐鹽菌株生長(zhǎng)曲線的建立

對(duì)3 株植物乳桿菌中耐鹽性較好的菌株FS5-5，參照GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，在菌株生長(zhǎng)過(guò)程中采用傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。構(gòu)建菌株在NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.4蛋白質(zhì)樣品的提取與制備

1.4.1菌體的培養(yǎng)與收集

參照Lorena等［13］收集菌株在含有NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中期的菌體。為保證培養(yǎng)基pH值的穩(wěn)定，向其中添加MOPS和MES，以減小pH值對(duì)菌體中蛋白的影響。

1.4.2植物乳桿菌全蛋白的提取

將收集到的菌體，利用研缽采用液氮研磨法對(duì)菌體進(jìn)行研磨破碎。將研好的菌體三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）/丙酮法制取全蛋白樣品［14］。

1.4.3蛋白質(zhì)的裂解

分別取一定量的菌體蛋白質(zhì)干粉，加入400 .L的裂解液，進(jìn)行超聲助溶10 min。之后放入冰盒中搖床振蕩2 h，然后4 ℃、20 000×g離心1 h，棄沉淀，在上清中加入DNase I （1 U/50 .L）和RNase A（25 .g/.L），于4 ℃冰箱中消化過(guò)夜以去除其中的核酸。最后將蛋白質(zhì)裂解液分裝，于-20 ℃短期保存［15］。

1.4.4Bradford微量蛋白質(zhì)測(cè)定法

配制10 mg/mL牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）儲(chǔ)存液，稀釋至1 mg/mL母液。按照Bradford微量蛋白質(zhì)測(cè)定法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度［16］。

1.4.5SDS-PAGE方法鑒定蛋白

利用SDS-PAGE方法對(duì)在不同鹽質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)的植物乳桿菌蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。灌制分離膠12%，濃縮膠5%［17］。梯度膠為預(yù)制的4%～20%的梯度膠。電泳條件：80 V，10 min；120 V，2 h。

1.4.6染色與脫色

電泳完畢，取下凝膠用去離子水清洗凝膠表面殘留的電泳液等。然后用提前加熱至95 ℃的考馬斯亮藍(lán)染色液，將凝膠染色20 min。染色完畢，用去離子水清洗凝膠表面，去除多余的染色液，最后用脫色液將凝膠脫色。直至出現(xiàn)清晰的條帶為止，期間可以更換幾次脫色液。

1.4.7圖像分析

利用Image Lab軟件對(duì)所得的SDS-PAGE圖譜進(jìn)行分析，找出差異條帶。

1.4.8蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

從膠上選取差異蛋白條帶，切下后放入干凈的1.5 mL離心管中，脫色后經(jīng)胰蛋白酶消化，并利用AB Sciex 4000 QTRAP.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS）對(duì)肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4.9生物信息學(xué)分析

通過(guò)軟件Mascot 2.3.01（Matrix Science），以NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中革蘭氏陽(yáng)性菌已知數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲取蛋白質(zhì)信息。查詢條件設(shè)定為：物種來(lái)源：乳桿菌屬；表觀等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）與表觀相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular mass，Mr）的誤差范圍設(shè)定為：無(wú)限制；一級(jí)質(zhì)譜精度（peptide mass tolerance）：±50×10-6，二級(jí)質(zhì)譜精度（fragment mass tolerance）：±0.25 u；固定修飾：半胱氨酸碘乙酰胺化（carbamidomethyl）；可變修飾：蛋氨酸氧化（methionine oxidation）［18］。當(dāng)檢索結(jié)果蛋白分?jǐn)?shù)超過(guò)19時(shí)，可靠性達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1耐鹽植物乳桿菌的篩選

對(duì)已鑒定的3 株耐鹽性較好的乳酸菌進(jìn)行更細(xì)致的分離，測(cè)定其在不同鹽質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)24 h后的OD600nm值，確定一株耐鹽性較好的植物乳桿菌，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　3 株植物乳桿菌在不同鹽質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)情況（OODD60000　nnmm）Table 1　Growth status of 3Lactobacillus plantaarruumm strains undeerr different NaCl concentrations （OODD60000　nnmm）

由表1可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到14 g/100 mL時(shí)，3 株植物乳桿菌基本上不再生長(zhǎng)，所以最高的生長(zhǎng)質(zhì)量濃度在12 g/100 mL左右。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為12 g/100 mL時(shí)，DL3-1的OD600nm值為0.103；DL4-5的OD600nm值為0.097；FS5-5的OD600nm值為0.137。所以確定3 株植物乳桿菌中，F(xiàn)S5-5的耐鹽性最好。

2.2FS5-5在不同鹽質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線

圖1　植物乳桿菌FS5-5在不同鹽質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curves of Lactobacillus plantarum FS5-5 in different salt concentrations

對(duì)菌株FS5-5采用菌落計(jì)數(shù)的方法建立其生長(zhǎng)曲線。將活化3 代的植物乳桿菌FS5-5接種到不同鹽質(zhì)量濃度的MRS培養(yǎng)基中。在菌株的生長(zhǎng)過(guò)程中，每間隔2 h，參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2010采用傾注法測(cè)定其菌落數(shù)，每個(gè)質(zhì)量濃度做兩個(gè)平行。根據(jù)測(cè)得結(jié)果，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建菌株FS5-5在NaCl質(zhì)量濃度為0、3、6、9 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。在0 g/100 mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌FS5-5的對(duì)數(shù)期中期為生長(zhǎng)6 h。在3 g/100 mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌FS5-5的對(duì)數(shù)期中期為生長(zhǎng)6 h。在6 g/100 mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌FS5-5的對(duì)數(shù)期中期為生長(zhǎng)10 h。在9 g/100 mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌FS5-5的對(duì)數(shù)期中期為生長(zhǎng)21 h。

2.3樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果

采用最基本的方法——Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），595 nm波長(zhǎng)處的OD值為縱坐標(biāo)（y），可得到回歸方程：y=6.898 2x+0.037 3（R2=0.999 5），表明在該蛋白質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品在0、3、6、9 g/100 mL NaCl條件下的蛋白質(zhì)含量分別為13.51、15.67、7.36、16.95 mg/mL。提取的蛋白質(zhì)的含量均大于4 mg/mL，能夠滿足SDS-PAGE的需要。

2.4FS5-5不同鹽質(zhì)量濃度下蛋白質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖2　不同鹽質(zhì)量濃度下蛋白質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGEE圖譜Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis of protein expression profiles under different salt concentrations

由圖2A可知，由于蛋白條帶較多，分離效果不明顯，很多條帶沒(méi)有分離開(kāi)，尤其是15～40 ku之間。由圖2B可知，由于Bio-Rad 18.5 cm×20 cm膠較長(zhǎng)，蛋白分離效果要明顯好于Bio-Rad Mini 聚丙烯酰胺凝膠，條帶也相對(duì)清晰。由圖2C可知，4%～20%梯度膠對(duì)蛋白質(zhì)的分離較為清晰，在6 g/100 mL對(duì)數(shù)期條帶中，在16 ku處有2 個(gè)條帶表達(dá)明顯。但是由于梯度膠較短而樣品中蛋白質(zhì)種類較多，導(dǎo)致有很多蛋白緊密相連，不易區(qū)分開(kāi)來(lái)。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌FS5-5在不同鹽質(zhì)量濃度環(huán)境下，蛋白質(zhì)表達(dá)差異很小。

2.5圖像分析結(jié)果

由于Bio-Rad 18.5 cm×20 cm分離效果相對(duì)較好，所以利用Image Lab軟件對(duì)其所得的SDS-PAGE圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　不同SDS-PAGE泳道的圖譜分析Fig.3　Analysis of different SDS-PAGE lanes

對(duì)圖3A～3D的圖譜結(jié)果進(jìn)行分析整理合并，可以得到不同泳道蛋白質(zhì)條帶對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量，結(jié)果如表2所示。

表2　不同泳道蛋白質(zhì)條帶對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量Table 2 Molecular weights of different protein bands

通過(guò)對(duì)Image Lab軟件自動(dòng)分析的結(jié)果（圖3和表2）可以看出，植物乳桿菌在3 g/100 mL NaCl條件下，全蛋白的表達(dá)與0 g/100 mL NaCl條件下相比基本上沒(méi)有差異；在6 g/100 mL NaCl條件下，1號(hào)泳道中的4號(hào)和7號(hào)條帶是缺失的，3號(hào)泳道中增加了一條分子質(zhì)量大約為14.3 ku的條帶，同時(shí)在分子質(zhì)量大約為6.6 ku時(shí)蛋白表達(dá)量明顯增加；在9 g/100 mL NaCl條件下，4號(hào)泳道中的4號(hào)和7號(hào)條帶也是缺失的，增加了一條分子質(zhì)量大約為14.3 ku的條帶。所以將1號(hào)泳道中的4號(hào)蛋白條帶定義為1號(hào)樣品，6號(hào)條帶定義為2號(hào)樣品，3號(hào)泳道中的24號(hào)條帶定義為3號(hào)樣品，31號(hào)條帶定義為4號(hào)樣品，對(duì)梯度膠中兩條差異比較明顯的條帶定義為5號(hào)、6號(hào)樣品。

2.6蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)檢索

將1、2、3、4、5、6號(hào)樣品條帶切下后放入干凈的1.5 mL離心管中，脫色后經(jīng)胰蛋白酶消化，并利用LC-MS/MS對(duì)肽段樣品進(jìn)行分析。通過(guò)軟件Mascot 2.3.01（Matrix Science），以NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中革蘭氏陽(yáng)性菌已知數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲取蛋白質(zhì)信息。

表3　與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白Table 3 Proteins associated with protein synthesis

表4　與代謝相關(guān)的蛋白Table 4 Proteins associated with metabolism

表5　與DNA合成有關(guān)的蛋白Table 5　Proteins associated with DNA synthesis

在檢測(cè)的6 個(gè)條帶中，差異蛋白條帶均為蛋白混合物。1號(hào)樣品條帶鑒定得到6 種蛋白；2號(hào)樣品條帶鑒定得到11 種蛋白；3號(hào)樣品條帶鑒定得到9 種蛋白；4號(hào)樣品條帶鑒定得到4 種蛋白；5號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白；6號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白。去除相同的蛋白，共有45 種蛋白得到鑒定。這些蛋白大致可以分為4 類：與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白25 種（表3）；與代謝相關(guān)的蛋白10 種（表4）；與核苷酸合成有關(guān)的蛋白8 種（表5）；未知功能蛋白2 種，分別為xaa蛋白的二肽基肽（Xaa-Pro dipeptidylpeptidase）和非規(guī)范嘌呤NTP焦磷酸酶（non-canonical purine NTP pyrophosphatase），如表6所示。

表6　未知功能蛋白Table 6　Proteins with unknown functions

3　討 論

鹽脅迫反應(yīng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生理過(guò)程，當(dāng)植物乳桿菌FS5-5在一定鹽質(zhì)量濃度的外界環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，為了抵御外界鹽質(zhì)量濃度環(huán)境的影響，其本身蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)發(fā)生一系列變化，從而使自己能夠更好地在鹽質(zhì)量濃度環(huán)境下生長(zhǎng)［19］。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變化最多的蛋白大致可以分為三大類：與對(duì)蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白；與代謝有關(guān)的蛋白；與核苷酸合成有關(guān)的蛋白。

3.1 與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白

蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程可以分為起始、延伸和終止3 個(gè)階段，每一階段都會(huì)有各自相關(guān)的蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用［20-21］。通過(guò)對(duì)植物乳桿菌FS5-5的SDS-PAGE差異條帶的鑒定得到翻譯起始因子2、翻譯起始因子3、延伸因子Tu、延伸因子4、延伸因子G、核糖體成熟因子RimM。由此可見(jiàn)，當(dāng)菌株應(yīng)對(duì)外界壓力時(shí)，在蛋白質(zhì)的合成過(guò)程中從起始因子到最后的成熟因子都發(fā)生了一系列的變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生差異。同時(shí)，表達(dá)差異較多的還有核糖體蛋白，包括30S核糖體蛋白、50S核糖體蛋白等。

3.2 與代謝有關(guān)的蛋白

從目前報(bào)道的相關(guān)結(jié)果來(lái)看，糖代謝相關(guān)蛋白的變化，對(duì)乳酸菌應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激具有極其重要的作用。糖代謝反應(yīng)主要為糖酵解途徑，是指細(xì)胞通過(guò)消耗葡萄糖生成丙酮酸同時(shí)釋放出一定能量的過(guò)程。當(dāng)乳酸菌面臨外界不利環(huán)境脅迫時(shí)，乳酸菌消耗的能量就會(huì)增加，從而會(huì)使糖酵解途徑中相關(guān)的酶發(fā)生變化［22］。3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶。在細(xì)胞的糖代謝過(guò)程中，3-磷酸甘油醛脫氫酶催化3-磷酸甘油醛脫氫、加磷酸，其輔酶為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），反應(yīng)脫下的氫交給NAD+成為NADH+H+；反應(yīng)時(shí)釋放的能量?jī)?chǔ)存在所生成的1，3-二磷酸甘油酸1位的羧酸與磷酸構(gòu)成的混合酸酐內(nèi)，此高能磷酸基團(tuán)可將能量轉(zhuǎn)移給ADP形成ATP，從而使能量增加［23］，有利于菌株在鹽脅迫條件下更好地存活下來(lái)。

3.3與核苷酸合成有關(guān)的蛋白

DNA的正確復(fù)制是保證乳酸菌存活、增殖的必備條件，也是蛋白質(zhì)氨基酸序列合成的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中鑒定得到了8 種與核苷酸相關(guān)的蛋白，當(dāng)乳酸菌受到外界脅迫時(shí)，基因序列的復(fù)制會(huì)受到影響，此時(shí)一些相關(guān)的與DNA相關(guān)的酶發(fā)生作用，以確保DNA的正確復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)中鑒定得到了DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白Muts。DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白是通過(guò)修復(fù)由于DNA復(fù)制時(shí)的錯(cuò)誤而使基因組保持穩(wěn)定的一種蛋白。在鹽脅迫條件下鑒定出該種蛋白，說(shuō)明外界環(huán)境已經(jīng)影響到了該菌株DNA的正常復(fù)制［24-25］。所以與核苷酸合成相關(guān)的蛋白有效地保護(hù)了乳酸菌的DNA的正確復(fù)制，從而使得該菌株能夠耐受鹽性環(huán)境的脅迫而存活、增殖。

4　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以植物乳桿菌FS5-5為研究對(duì)象，采用SDS-PAGE技術(shù)構(gòu)建該菌株在NaCl質(zhì)量濃度為0、3、6、9 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中期蛋白質(zhì)一維圖譜，并對(duì)圖譜進(jìn)行比較分析，找出差異蛋白條帶，并利用LC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。

共鑒定了6 個(gè)蛋白質(zhì)條帶，均為蛋白混合物。1號(hào)樣品條帶鑒定得到6 種蛋白；2號(hào)樣品條帶鑒定得到11 種蛋白；3號(hào)樣品條帶鑒定得到9 種蛋白；4號(hào)樣品條帶鑒定得到4 種蛋白；5號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白；6號(hào)樣品條帶鑒定得到15 種蛋白。去除相同的蛋白，共有45 種蛋白得到鑒定。這些蛋白大致可以分為4 類：與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白25 種；與代謝相關(guān)的蛋白10 種；與核苷酸合成有關(guān)的蛋白8 種；未知功能蛋白2 種。也許正是由于這些蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，才導(dǎo)致菌體中蛋白質(zhì)的合成、能量代謝、DNA的復(fù)制能夠正常的進(jìn)行，最終使植物乳桿菌FS5-5能夠更好地在鹽環(huán)境下生存。

［1］BOLOTIN A， WINCKER P， MAUGER S， et al. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403［J］. Genome Research， 2001， 11（5）： 731-739.

［2］烏日娜， 孫志宏， 張文羿， 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)在乳酸菌應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制研究中的應(yīng)用［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（1）： 324-327.

［3］da SILVA SABO S， VITOLO M， JOS. MANUEL DOMíNGUEZ GONZ.LEZ J M D， et al. Overview of Lactobacillus plantarumas a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria［J］. Food Research International， 2014， 64（10）： 527-536.

［4］VERONICA F， ANDREA B， JORGE R， et al. Resistance of functional Lactobacillus plantarum strains against food stress conditions［J］. Food Microbiology， 2015， 48（6）： 63-71.

［5］WU Rina， WU Junrui， YUE Xiqing， et al. Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacterium Lactobacillus casei-Zhang to low acid stress［J］. International Journal of Food Microbiology， 2011，147（3）： 181-187.

［6］JOHANNA K， KATI L， KERTTU K， et al. Effect of acid stress on protein expression and phosphorylation in Lactobacillus rhamnosus GG［J］. Journal of Proteomics， 2012， 75（4）： 1357-1374.

［7］LEE J Y， PAJARILLO E A B， KIM M J. Proteomic and transcriptional analysis of Lactobacillus johnsonii PF01 during bile salt exposure by iTRAQ shotgun proteomics and quantitative RT-PCR［J］. Journal of Proteome Research， 2013， 12（1）： 432-443.

［8］BELFIORE C， FADDA S， RAYA R， et al. Molecular basis of the adaption of the anchovy isolate Lactobacillus sakei CRL1756 to salted environments through a proteomic approach［J］. Food Research International， 2013， 54（1）： 1334-1341.

［9］ZHAO Shanshan， ZHANG Qiuxiang， HAO Guangfei， et al. The protective role of glycine betaine in Lactobacillus plantarum ST-III against salt stress［J］. Food Control， 2014， 44： 208-213.

［10］ LI Chun， LIU Libo， SUN Di， et al. Response of osmotic adjustment of Lactobacillus bulgaricus to NaCl stress［J］. Journal of Northeast Agricultural University， 2012， 9（4）： 66-74.

［11］ LEONTIEV L， SELIVERSTOV A， LYUBETSKY V. Algorithm for a large-scale search for T-Box transcription regulation in bacteria［J］. Molecular Microbiology， 2005， 39（6）： 946-948.

［12］ 徐鑫， 王茜茜， 烏日娜， 等. 傳統(tǒng)農(nóng)家大醬中耐鹽性乳酸菌的分離與鑒定［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2014， 40（11）： 33-40.

［13］ LORENA R， YOHANN C， BORJA S， et al. The cell-envelope proteome of Bifi dobacterium longum in an in vitro bile environment［J］. Microbiology， 2009， 155（3）： 957-967.

［14］ 烏日娜. 益生菌Lactobacillus casei Zhang蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

［15］ 何慶華， 吳永寧， 印遇龍. 乳酸菌差異蛋白組學(xué)研究進(jìn)展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33（8）： 113-116.

［16］ 王延華， 形如新， 游潮. 蛋白質(zhì)理論與技術(shù)［M］. 2版. 北京： 科學(xué)出版社， 2009： 225-230.

［17］ WU Rina， XU Xin， MENG Lingshuai， et al. Identification of salt stress responsive protein in Lactobacillus parac asei LN-1 using SDSPAGE［J］. IERI Procedia， 2014， 8（1）： 60-65.

［18］黃桂東. Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸脅迫下差異表達(dá)蛋白的研究［D］. 南昌： 南昌大學(xué)， 2011.

［19］ 周方方， 吳正鈞， 艾連中， 等. 蛋白組學(xué)技術(shù)在乳酸菌環(huán)境脅迫應(yīng)激研究中的應(yīng)用［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2012， 38（8）： 101-106.

［20］ de LEEUW F， ZHANG T， WAUQUIER C， et al. The cold-inducible RNA-binding protein migrates from the nucleus to cytoplasmic stress granules by a methylation-dependent mechanism and acts as a translational repressor［J］. Experimental Cell Research， 2007， 313（20）：4130-4140.

［21］ MITHU M， DANIEL M， SERGEI M， et al. Residues required for phosphorylation of translation initiation factor IF2 under diverse stress conditions are divergent between yeast and human［J］. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology， 2015， 59（2）：135-141.

［22］ KISTRUP M， JACOBSEN S， HAMMER K， et al. Induction of heat shock proteins DnaK， GroEL and GroES by salt stress in Lactococcus lactis［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（5）： 1826-1837.

［23］ MICHAEL A， SIROVE R. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity［J］. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology， 2014， 57（1）： 20-26.

［24］ BI Lijun， ZHANG Xianen， ZHOU Yafeng. Observation of the interaction between MutS and MutL mismatch repair proteins by fusion protein syste ms［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics，2005， 32（12）： 1178-1183.

［25］ 鐘天映， 畢利軍， 張先恩. 錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutS的新功能位點(diǎn)［J］. 中國(guó)科學(xué)： 生命科學(xué)， 2011， 41（2）： 168-172.

SDS-PAGE Analysis of Total Proteins in Lactobacillus plantarum in the MiddleLogarithmic Growth at Different Salt Concentrations

WU Rina1，2， XU Xin1， WANG Qianqian1， SONG Xuefei1， XUE Yating1， TANG Xiaoyang1， WU Junrui1，*
（1. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang110866， China； 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology， College of Food Science， Jiangnan University， Wuxi214122， China）

In this study， the total protein profiles of Lactobacillus plantarum FS5-5 with salt tolerance grown in media with NaCl concentrations of 0， 3， 6， and 9 g/100 mL to the middle logarithmic phase were established and compared by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）， and six different protein bands were selected for analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （AB Sciex 4000 QTRAP.LC/MS/MS）. Results showed that 6， 11， 9， 4， 15 and 15 proteins were contained in bands 1， 2， 3， 4， 5 and 6， respectively. Totally 45 proteins were identified. These proteins could be divided into 4 groups including 25 proteins involved in protein synthesis， 10 proteins associated with metabolism， 8 proteins associated with nucleotide synthesis， and 2 proteins with unknown functions. The differential expression of these proteins could lead to bacterial protein synthesis， energy metabolism and DNA replication， and eventually enable Lactobacillus plantarum FS5-5 to better survive in salt stress environment.

Lactobacillus plantarum FS5-5； salt stress； sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）； different proteins

Q939.117

A

1002-6630（2015）23-0155-07

10.7506/spkx1002-6630-201523029

2015-01-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31000805；31471713）；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LR2015059）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1402071C）；沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才支持計(jì)劃”項(xiàng)目

烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：wrn6956@163.com

武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：junruiwu@126.com