姚霞，明紅梅，周健，陳曉旭，陳蒙恩，朱莉莉

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

十個濃香型大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

姚霞，明紅梅*，周健，陳曉旭，陳蒙恩，朱莉莉

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

研究濃香型大曲的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并根據(jù)這些化合物對大曲風(fēng)味做初步評定，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）技術(shù)檢測大曲中的揮發(fā)性物質(zhì)，用乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物，半定量這些化合物的含量，并用主成分分析法對揮發(fā)性物質(zhì)和大曲樣進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：從10個大曲樣品檢測出46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要以酯類、吡嗪類、芳香類為主；主要的揮發(fā)性化合物是2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪等；對10個大曲樣本進(jìn)行主成份分析，6號樣風(fēng)味最好，10號樣其次，1號風(fēng)味最差。通過對大曲中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究，可為大曲風(fēng)味質(zhì)量判斷提供一定的理論參考價值。

濃香型大曲；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；頂空固相微萃?。粴赓|(zhì)聯(lián)用；主成分分析

大曲是釀制大曲酒用的糖化劑、發(fā)酵劑和增香劑［1-3］，含有多種微生物及產(chǎn)生的多種酶類，降解的原料成分和微生物代謝產(chǎn)物直接或間接地構(gòu)成了白酒的風(fēng)味物質(zhì)［4］，像氨基酸類、芳香族類等物質(zhì)為白酒的香味呈現(xiàn)起著重要作用［5］，對曲酒的風(fēng)味和口感都有極大的影響。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GCMS）是研究復(fù)雜體系揮發(fā)性物質(zhì)的一項(xiàng)實(shí)用技術(shù)［6］，廣泛被一些專家學(xué)者用于大曲、食品、藥材等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測［7-9］。本研究對選取的10個濃香型大曲樣本先進(jìn)行頂空固相微萃取，在氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行解析檢測大曲中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并對這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行半定量分析，利用主成分分析法對檢測的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和10個濃香型大曲樣本分別進(jìn)行分析，對本次大曲樣中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)給以確認(rèn)，也對這10個大曲樣進(jìn)行評價。這對研究大曲乃至大曲酒中風(fēng)味物質(zhì)提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

大曲樣品：瀘州老窖制曲生態(tài)園提供。由有經(jīng)驗(yàn)的工人在一批成曲中幫忙挑選10塊大曲，編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別粉碎過40目篩，混合均勻，存入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

50 μm/30 μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭、手動SPME進(jìn)樣器、15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶：美國Supelco公司；Agligent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；KQ-500DE型超聲波振蕩儀：昆山市超生儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1頂空固相微萃取（SPME）條件

選取50μm/30μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭，第一次使用時需于氣相色譜進(jìn)樣口230℃老化5 min。

樣品處理：取3g樣品和10μL內(nèi)標(biāo)溶液放入頂空瓶中，蓋上瓶蓋，60℃水浴超聲波震蕩儀中平衡15min，然后插入萃取頭，再60℃水浴頂空萃取30 min；GCMS進(jìn)樣口解吸4 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX，規(guī)格為（60 m×250 μm×0.25 μm）；手動無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230℃；程序升溫：40℃保持1 min，然后5℃/min升溫到180℃，保持1 min，再8℃/min升溫到230℃，保持7 min；載氣：高純度氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍20 u～550 u，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

1.2.3定性與半定量分析

定性：檢出揮發(fā)性組分物質(zhì)的質(zhì)譜圖，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST05a.L）對比鑒定，匹配度大于800的予以確認(rèn)。

半定量：選擇乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，乙醇為溶劑，配制乙酸丁酯濃度為1.76×10-5g/mL，取10 μL與3 g樣品混勻，再進(jìn)行頂空固相微萃取。先將大曲樣品中鑒定的化合物質(zhì)的峰面積與乙酸丁酯峰面積之比來初步判斷這些揮發(fā)性化合物的含量，再根據(jù)乙酸丁酯質(zhì)量濃度來進(jìn)一步計算這些揮發(fā)性化合物的含量［12］，由于沒有多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對揮發(fā)性香味物質(zhì)定量分析為本次萃取條件下的相對含量，故稱半定量。

1.3數(shù)據(jù)處理方法

采用主成分分析法確定貢獻(xiàn)率較大的香味成分［10］。主成分分析法把原來眾多具有一定相關(guān)的多個指標(biāo)（比如P個指標(biāo)）重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)，使復(fù)雜的問題簡單化，便于抓住主要矛盾進(jìn)行分析［11-13］。

將香味成分?jǐn)?shù)據(jù)錄入SPSS19.0根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，求出特征根及其相應(yīng)的特征向量，從特征根中選出幾個較大的特征根及其特征向量，累積貢獻(xiàn)率在80%以上的前幾個成分作為主成分進(jìn)行分析［14-15］，找出主要貢獻(xiàn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1十個大曲樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

十個大曲樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過計算機(jī)譜庫查詢，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［8-10，15］檢索，共檢出46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分七類，其中醇類2種、酸類1種、醛類2種、烯類5種、吡嗪類11種、酯類16種、芳香類9種。大曲樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量，如表1所示，不同的大曲樣品檢測的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量有一定差別，6、10號樣品檢測到的最多，3號樣其次，1號樣品最少。

表1　大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及含量Table 1The volatiles flavor compositions and their cotents in Daqu sample

續(xù)表1大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及含量Continue table 1The volatiles flavor compositions and their cotents in Daqu sample

2.2十個大曲樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

利用軟件SPSS19.0對10個大曲樣品的46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。得到主成分的特征值和貢獻(xiàn)率如表2，主成份分析碎石圖如圖1，主成分載荷矩陣如表3。

主成份確定一般根據(jù)因子的累計貢獻(xiàn)率、特征值以及碎石圖拐點(diǎn)的變化趨勢等因素來確定［11］。根據(jù)表2，前四個主成分特征值分別為24.661、7.037、4.004、2.843均大于1，方差貢獻(xiàn)率分別為53.612%、15.298%、8.704%、6.180%，其累計貢獻(xiàn)率達(dá)到83.794%，根據(jù)主成分分析一般提取主成分包含80%以上信息原理，前四個主成分包含了46種揮發(fā)性香味物質(zhì)的絕大部分信息；根據(jù)圖1，前四個主成分折線趨勢很陡，在第五個主成分開始折線開始變的平緩；因此取前四個主成分說明46種揮發(fā)性香味物質(zhì)的變化趨勢，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小，依次定為第一、第二、第三、第四主成分。

表2　主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 2Eigenvalues contribution and cumulative contribution of principal components

圖1　主成分分析碎石圖Fig.1The principal component analysis scree plot

表3　主成分載荷矩陣Table 3The principal component loading matrix

續(xù)表3主成分載荷矩陣Continue table 3The principal component loading matrix

由表3可知，第一主成分反映的指標(biāo)主要有2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯基丙酮、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、月桂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、萘、環(huán)辛烯、十五酸乙酯、丁酸乙酯、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、辛酸乙酯、苯甲醛、2，6-二乙基吡嗪、異丁酸、2-甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯，主要指向吡嗪類、酯類、芳香類物質(zhì)；第二主成分反映的指標(biāo)主要有1-十一烯、苯乙醇、E-11-十六烯酸乙酯、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪，主要指向吡嗪類、芳香類物質(zhì)；第三主成分反映的指標(biāo)主要有乙醛、2-丁烯醛、苯酚，主要指向醛類、芳香類物質(zhì)；第四主成分反映的指標(biāo)主要有正丁醇、1，2，4-三甲氧基苯，主要指向醇類、芳香類物質(zhì)。因此可以初步判斷以上揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為大曲的主要風(fēng)味物質(zhì)，主要指向吡嗪類、酯類、芳香類物質(zhì)。

圖2由10個大曲樣的第一主成分為橫坐標(biāo)，第二主成分為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖而得。

由圖2可知，10個大曲樣本可分為5簇，6號樣和其他樣品分開比較遠(yuǎn)，單獨(dú)成一簇，命為1簇；2、3、5、10號樣比較接近，可分為一簇，命為2簇；7、8號樣比較接近，命為3簇；4、9號樣比較接近命為4簇；1號樣單獨(dú)為一簇，命為5簇。

圖2　10個樣品的主成分散點(diǎn)圖Fig.2PCA biplot for 10 samples

圖3　46種香氣物質(zhì)主成分散點(diǎn)圖Fig.3PCA biplot for 46 identified aroma components

圖3由46種揮發(fā)性香味物質(zhì)的第一主成分值為橫坐標(biāo)，第二主成分值為縱坐標(biāo)（第一、第二主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)68.910%）做散點(diǎn)圖而得。綜合圖2、圖3可知，影響1簇即6號樣品的風(fēng)味物質(zhì)主要集中在第一象限，離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的位置，按影響力大小依次為己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、二甲基吡嗪、月桂酸乙酯、油酸乙酯、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、2，3-二甲基吡嗪、辛酸乙酯等；影響2簇樣品的風(fēng)味物質(zhì)也集中在第一象限，離原點(diǎn)較近的位置，按影響力大小依次為（E，E，E）-1，4，8-十二碳三烯、苯酚、2，6-二甲基吡嗪等；影響3簇樣品的風(fēng)味物質(zhì)集中在第一主成分的負(fù)半軸，主要影響物質(zhì)為E-1，9-十四碳二烯；影響4簇的風(fēng)味物質(zhì)主要集中在第二成分的負(fù)半軸，主要影響物質(zhì)為正丁醇；影響5簇的風(fēng)味物質(zhì)主要集中在第三象限，主要影響物質(zhì)為2，3-二甲基-5-乙基吡嗪。

以每個主成分所對應(yīng)的特征值占所提取的主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重，計算主成分綜合得分，即F值，再根據(jù)F值大小對10個大曲樣進(jìn)行排序，如表4所示，綜合得分越高說明大曲風(fēng)味越好，如此可以對大曲風(fēng)味進(jìn)行評定，繼而分級。

表410　個大曲樣綜合評價結(jié)果Table 4The comprehensive evaluation results of 10 Daqu samples

根據(jù)表4可知，6號大曲樣得分最高，風(fēng)味最好，其次是10號樣大曲，再其次是3號大曲樣，得分最低的是1號樣，即1號樣大曲風(fēng)味最差。

3結(jié)論

利用頂空固相微萃取，結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）測定10個大曲樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，共檢測出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)46種，包含酯類化合物，吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類化合物、烯類化合物、醇類化合物、酸類化合物。同時利用內(nèi)標(biāo)法對這些風(fēng)味成分進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)、吡嗪類物質(zhì)、芳香族類物質(zhì)含量比較高。

對檢測出的46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯基丙酮、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、月桂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、1-十一烯、苯乙醇為大曲的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。對10個大曲樣本進(jìn)行主成份分析，6號樣得分最高，風(fēng)味最好，10號樣其次，1號樣品得分最少，風(fēng)味最差。

本研究對10個大曲樣本的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行萃取分析，利用主成分分析法分析大曲風(fēng)味，為大曲風(fēng)味質(zhì)量的判斷提供了一種新的方法。

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Principal Components Analysis of Volatile Flavor Components from Ten Luzhou-flavor Daqu

YAO Xia，MING Hong-mei*，ZHOU Jian，CHEN Xiao-xu，CHEN Meng-en，ZHU Li-li
（Sichuan University of Science&Engineering of Bioengineering Institute，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to study the main volatile flavor substances in Luzhou-flavor Daqu and do the primary evaluation on Daqu level of flavor according to these compounds，headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography mass spectrometry（SPME-GC-MS）detection method was used，and using butyl acetate as the internal standard substance，semi quantitative the content of volatile compounds，analyze the compounds and Daqu samples by principal component analysis（PCA）.The results showed that：there were 46 kinds of volatile flavor substances detected in 10 Daqu samples，mainly contend esters，pyrazines，aromatic. Volatile flavour compounds mainly contend trimethyl-Pyrazine，Tetradecanoic acid ethyl ester，1-Phenyl-2-propanol，2，5-dimethyl-Pyrazine，Hexadecanoic acid ethyl ester，tetramethyl-pyrazine and so on.Analyze 10 Daqu samples by PCA，the flavor of the best was sample 6，secondly was sample 10，No.1 had the worst flavor. Through the research on the main volatile flavor compounds of Daqu，it could provide some theory reference value for Daqu quality judgment.

Luzhou-flavor Daqu；volatile flavor components；headspace solid phase micro-extraction，gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）；principal component analysis（PCA）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.005

2015-05-09

瀘州老窖科研獎學(xué)金項(xiàng)目（13ljzk04）；研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（y2014028）

姚霞（1988—），女（漢），在讀研究生，研究方向：釀酒微生物研究及應(yīng)用。

明紅梅（1971—），女，副教授，從事釀酒微生物研究。