任蓓蕾，李志輝，田洪濤，杜萍萍，張瑩瑩，馬　雯，鎖　然，何俊萍，檀建新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071000）

生香酵母C42真空冷凍干燥保護(hù)劑的篩選和優(yōu)化

任蓓蕾，李志輝，田洪濤，杜萍萍，張瑩瑩，馬雯，鎖然，何俊萍，檀建新*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071000）

為了獲得生香酵母C42的冷凍干燥保護(hù)劑，應(yīng)用Plackett-Burman（PB）、最陡爬坡和Box-Benhnken（BBD）三種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)真空冷凍干燥制備生香酵母C42活性干酵母的保護(hù)劑進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明最優(yōu)的保護(hù)劑配方為：2.90%甘油，10.33%棉籽糖，9.63%谷氨酸鈉，所得酵母菌的存活率為80.56%±1.19%，為該菌種的保存和后續(xù)研究應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

生香酵母，冷凍干燥，響應(yīng)面法，保護(hù)劑

高活性干酵母是一種結(jié)合生物工程、酵母產(chǎn)業(yè)和干燥應(yīng)用技術(shù)發(fā)展起來(lái)的高科技、高效能產(chǎn)品，具有含水量低，易于運(yùn)輸保存，發(fā)酵性能好，穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)［1］?，F(xiàn)代活性干酵母的研究主要集中在生物工程酵母菌的構(gòu)建、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究和AADY技術(shù)的研究三個(gè)方面。最初的菌株篩選是從自然界中直接篩選目標(biāo)菌株?，F(xiàn)代酵母工業(yè)中，更多的研究集中在采用生物工程改造技術(shù)選育出專一性強(qiáng)、發(fā)酵力高的釀酒酵母新品種。然后利用干燥技術(shù)制備成高活性干酵母用于生產(chǎn)。為防止酵母菌受到危害，干燥過(guò)程中常加入一定的保護(hù)劑。為了獲得好的保護(hù)效果，需要進(jìn)行科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，首先查閱文獻(xiàn)獲得能影響酵母生物量的保護(hù)劑組分，然后采用Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從中選擇出主要的因素，并對(duì)主要的因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（最陡爬坡實(shí)驗(yàn)），再采用Box-Behnken（BBD）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1-3］。

生香酵母是一類在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生使人愉悅的香味物質(zhì)的酵母菌的統(tǒng)稱。其在發(fā)酵過(guò)程中能夠合成多種物質(zhì)如酯、酸、高級(jí)醇和醛等產(chǎn)物，對(duì)調(diào)味品和酒的風(fēng)味、質(zhì)地和色澤的形成起到重要的作用［4-6］。本課題組前期工作篩選到一株產(chǎn)乙酸乙酯能力較為突出的酵母菌，鑒定并命名為異常威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus）C42，具有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值［7-8］。本文利用PB、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和BBD探討了該酵母菌真空冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)劑的添加種類和添加量，得到了最優(yōu)的保護(hù)劑配方和真空冷凍干燥工藝，為該菌種的保存及生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

異常維克漢姆酵母C42（Wickerhamomycesanomalus C42） 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；除蜂蜜外，甘油、棉籽糖、吐溫80、蔗糖、谷氨酸鈉、VC、木糖醇及其他試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司、Sigma公司；麥芽汁河北省保定市生力啤酒廠；麥芽汁液體培養(yǎng)基115℃，15min滅菌備用。

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SIGMA-3K15型離心機(jī)德國(guó)；FD-1型冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康技術(shù)公司；TU-1810型紫外可見光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MDF-U32V型超低溫冰箱日本SANYO公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定挑取適量斜面保存的生香酵母C42，接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h活化。然后按1%接種量接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h取培養(yǎng)液，在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光值［9］，重復(fù)測(cè)三次，取平均值。

1.2.2菌體離心條件的確定選擇適宜的離心條件不但能使菌體的存活率達(dá)到最大，還能保留菌體的活性。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)不同的離心速率和時(shí)間（見表1）優(yōu)化C42菌體收集的離心條件（離心溫度設(shè)定為-4℃）［10-11］。并采用稀釋涂布法計(jì)算離心前后C42的活菌數(shù)，計(jì)算離心存活率如下：

式（1）中，Rc為存活率；Nt為沉淀中的活菌數(shù)；N0為初始活菌數(shù)。

表1　離心條件的因素和水平Table 1　Factors and levels of centrifugation condition

1.2.3冷凍干燥保護(hù)劑的篩選及驗(yàn)證

1.2.3.1PB實(shí)驗(yàn)離心收集C42菌體，以預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得的10%脫脂乳為支撐底物，-80℃預(yù)凍3h，進(jìn)行真空冷凍干燥［12-13］。采用稀釋涂布法分別計(jì)算凍干前后C42的活菌數(shù)，計(jì)算凍干存活率。

式（2）中，Rc為存活率；Ct為冷凍干燥后的活菌數(shù)；C0為冷凍干燥前的活菌數(shù)。

對(duì)其中凍干過(guò)程中的8種保護(hù)劑進(jìn)行Plackett-Burman（PB）篩選（如表2）［7-8，14-16］。響應(yīng)變量為C42的存活率，共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)按照PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出對(duì)該酵母菌株冷凍干燥過(guò)程的保護(hù)效應(yīng)影響最顯著的三個(gè)因素，參照文獻(xiàn)［15，17］設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，逼近響應(yīng)面的最佳值區(qū)域。

1.2.3.3BBD實(shí)驗(yàn)在PB實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)BBD實(shí)驗(yàn)方案（表3），對(duì)三個(gè)影響顯著的保護(hù)劑的添加量進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)BBD優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。重復(fù)3次。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6（Stat-Ease Inc.，Min-neapolis，MN.USA）中Plackett-Burman（PB）、Central Composite Design（CCD）、Box-BehnkenDesign（BBD）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型的建立。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理3次重復(fù)，差異顯著性水平為0.01和0.05。

表2　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

表3　Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 3　Factors and levels of Box-Benhnken Design

2　結(jié)果與分析

2.1菌種生長(zhǎng)曲線的繪制

圖1　酵母菌C42的生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curve of yeast strain

圖1為生香酵母C42的生長(zhǎng)曲線圖，由圖1可知，菌株C42在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至18～20h時(shí)趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期?？紤]到冷凍干燥時(shí)，菌株的生物量及活性，選擇對(duì)數(shù)末期穩(wěn)定初期進(jìn)行菌體的離心收集，即18～20h最為適宜。

表4　Plackett-Burman design實(shí)驗(yàn)結(jié)果（N=12）Table 4　Response values of Plackett-Burman design（N=12）

2.2離心條件的確定

圖2　離心條件對(duì)酵母菌C42存活率的影響Fig.2　Effect of centrifugation condition on the survival of C42

離心條件對(duì)酵母存活率有一定影響。實(shí)驗(yàn)中選定3個(gè)離心速率，3個(gè)離心時(shí)間，對(duì)比離心后菌體存活率的影響，結(jié)果如圖2所示，在4500r/min的離心條件下離心20min時(shí)C42的存活率最高，達(dá)到95.5%。因此菌體最適離心收集條件為4500r/min，20min。

2.3Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果和不同影響因子的效應(yīng)分析見表4、表5。由表4和表5可知，對(duì)冷凍干燥后菌株C42存活率影響顯著的因素為甘油（p=0.0044）、棉籽糖（p= 0.0012）和谷氨酸鈉（p=0.0059）。因此選擇這3個(gè)因子作為影響菌株C42存活率的關(guān)鍵因素。而其他因子的p值均大于0.05，差異不顯著，故不作考慮。

2.4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)篩選出棉籽糖、谷氨酸鈉、甘油三個(gè)對(duì)提高酵母菌C42存活率影響顯著的因素，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，3%甘油、10%谷氨酸鈉、10%棉籽糖得到的酵母菌的存活率最高為63.70%。

2.5Box-BenhnkenDesign實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如表7所示。對(duì)表7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析（表8），結(jié)果表明所選模型的F=100.39，p＜0.0001，說(shuō)明不同處理間差異極顯著，可以認(rèn)為所選用的二次回歸方程是適當(dāng)?shù)?；R2=0.9923，說(shuō)明因變量Y與全體變量之間的線性關(guān)系顯著，R2adj= 0.9824說(shuō)明僅有1.76%的變異不能由該模型解釋。精密度為25.947，失擬項(xiàng)F=1.26，p=0.3988，差異不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)值和實(shí)際值相吻合，實(shí)驗(yàn)擬合性好，實(shí)驗(yàn)誤差小。實(shí)驗(yàn)根據(jù)模型得到優(yōu)化后的回歸方程為：Y=78.05-4.85A+2.09B-2.55C+5.44AB+3.30AC+ 1.13BC-24.44A2-11.18B2-18.82C2

表5　不同影響因子的效應(yīng)分析Table 5　The analyses of the significance of different factors

表6　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6　Steepest ascent design and response values

根據(jù)表7和表8分析結(jié)果，作出雙因子相應(yīng)的響應(yīng)曲面如圖3～圖5所示。

圖3～圖5分別表示A：甘油與B：棉籽糖、A：甘油與C：谷氨酸鈉和B：棉籽糖與C：谷氨酸鈉對(duì)酵母菌存活率的影響的曲面圖，由三組圖可以看出響應(yīng)曲面呈傘形，中心突起，說(shuō)明兩因素之間的影響基本呈拋物線型關(guān)系，均有一個(gè)極大值點(diǎn)，變化趨勢(shì)都是先增大后減小。即存在適宜的甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉的濃度使冷凍干燥后酵母菌的存活率達(dá)到最高。且AB、AC交互作用顯著，BC交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

以上分析表明存在適宜的甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉濃度有利于冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)酵母菌存活率最大。用Design-Export 8.0.6軟件分析，得出最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：甘油濃度2.90%，棉籽糖濃度10.33%，谷氨酸鈉濃度9.63%。在此配方的保護(hù)作用下，得到模型的最大預(yù)測(cè)值為78.45%。

表7　Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7　Box-Benhnken Design and response values

表8　Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 8　Analysis of variance on regression mode of Box-Benhnken design

圖3　A：甘油和B：棉籽糖相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖Fig.3　Corresponding 3d surface of A-glycerin and B-raffinose

圖4　A：甘油和C：谷氨酸鈉相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖Fig.4　Corresponding 3d surface of A-glycerin and C-sodium glutamate

按上述得到的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到冷凍干燥后的酵母菌存活率為80.56%±1.19%，接近預(yù)測(cè)值78.45%，且三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較好的重復(fù)性。因此可以說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化后得到的實(shí)驗(yàn)方案可靠性較高。

3　討論

3.1真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥法在低溫低壓下進(jìn)行，使熱敏性成分保留下來(lái)不變性，菌種存活率高，而且干制品含水量很低，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，復(fù)水性好。該技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)越性越來(lái)越多的應(yīng)用于生物及其他制品的干燥過(guò)程中。對(duì)于凍干酵母菌粉，也已經(jīng)有報(bào)道：王華等利用凍干技術(shù)制備了熱帶假絲酵母活性干粉，其存活率達(dá)到82.73%［18］；西北農(nóng)林科技大學(xué)的王雪鋒也是利用真空冷凍干燥技術(shù)制備了我國(guó)本土優(yōu)良的釀酒酵母Saccharomyces cerevisia LFN518的活性干粉，其存活率達(dá)到80%以上［2］。如果能夠確定合理的凍干工藝，優(yōu)化最佳保護(hù)劑配方，經(jīng)擴(kuò)大化實(shí)驗(yàn)逐步實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)，其創(chuàng)造的價(jià)值將不可限量。

3.2脫脂乳濃度的影響

在冷凍干燥過(guò)程中，保護(hù)劑主要有兩個(gè)功能：一是作為載體材料和復(fù)水受體，提供具有一定物理結(jié)構(gòu)的干燥后殘余物；二是在冷凍和干燥過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞不受損害。脫脂乳作為最常用的微生物菌體優(yōu)良保護(hù)劑之一，已得到廣泛的應(yīng)用，在冷凍干燥過(guò)程中，它能作為支架物質(zhì)，形成一種輕而多孔的結(jié)構(gòu)，使干燥后容易復(fù)水，而且能夠保持其他物質(zhì)的性能。因此，無(wú)論是單獨(dú)使用或者與其他物質(zhì)混合使用，脫脂乳都能起到很好的保護(hù)效果［13］。因此，本文根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇脫脂乳濃度為10%作為后續(xù)保護(hù)劑的篩選基礎(chǔ)。

3.3保護(hù)劑的優(yōu)化

在酵母菌干燥的過(guò)程中添加保護(hù)劑是有效提高酵母菌存活率和性能的最佳方法之一。關(guān)于凍干保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理普遍接受的有3種假說(shuō)：優(yōu)先替代假說(shuō)；水替代假說(shuō)；玻璃態(tài)假說(shuō)。三種假說(shuō)都在一定程度上說(shuō)明保護(hù)劑保護(hù)機(jī)理的某些特性。因此，根據(jù)不同的假說(shuō)說(shuō)明的保護(hù)劑機(jī)理，凍干保護(hù)劑被分為幾類：碳水化合物類、聚合物類、蛋白質(zhì)類、氨基酸類和其他類保護(hù)劑。目前常用的保護(hù)劑主要有海藻糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖、二甲基亞砜、甘油、脫脂乳粉等［19］。本實(shí)驗(yàn)中選用8種常用的保護(hù)劑種類通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出了生香酵母C42最適的冷凍干燥保護(hù)劑配方，制備出了符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且不明顯低于其他方法制備的活性干酵母存活率。因此，可用于對(duì)酵母菌的保存和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

4　結(jié)論

研究了生香酵母C42菌體收集的最佳時(shí)間為18～20h，離心收集條件為速率4500r/min，時(shí)間20min，并以脫脂乳為支架物質(zhì)研究了8種保護(hù)因素，篩選出了影響最顯著的三個(gè)因素分別為甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉。以C42的存活率為響應(yīng)值Y，通過(guò)BBD實(shí)驗(yàn)，建立了模型的回歸方程，得出優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)方案為：10%脫脂乳，2.90%甘油，10.33%棉籽糖，9.63%谷氨酸鈉。在此條件下，冷凍干燥后酵母菌的存活率為80.56%±1.19%。

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Screening and optimization of vacuum freeze-drying protective agent formula for an aroma-producing yeast strain C42

REN Bei-lei，LI Zhi-hui，TIAN Hong-tao，DU Ping-ping，ZHANG Ying-ying，MA Wen，SUO Ran，HE Jun-ping，TAN Jian-xin*
（Agricultural University of Hebei，College of Food Science and Technology，Baoding 071000，China）

To obtain the vacuum freeze-drying protective agents for an aroma-producing yeast strain C42，Plackett-Burman（PB），the steepest ascent experiment and BBD were used to screen the protective agent formula by vacuum freeze-drying method.As a result，the survival rate of aroma-producing yeast strain C42 was 80.56%±1.19%under the optimal freeze-drying conditions which consisted of 2.90%of glycerin，10.33% of raffinose and 9.63%sodium glutamate，which laid a firm foundation for preservation，the further research and application of the yeast strain C42.

aroma-producing yeast；freeze-drying；response surface method；protective agents

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.024

2014－07－07

任蓓蕾（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

檀建新（1968-），男，博士，教授，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金（2012GB2A200030）；國(guó)家自然基金（31171725，31071494）。