汪　慧，錢巧珍，王　靜，顧亞琴，舒　燕，酈紅巖

HPLC法同時(shí)測(cè)定地錦草中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量

汪慧，錢巧珍，王靜，顧亞琴，舒燕，酈紅巖

目的 建立同時(shí)測(cè)定地錦草藥材中蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定方法。方法 色譜柱： Kromasil C18（5 μm，250×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸（20:80:0.15）；流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，柱溫：30 ℃。結(jié)果 蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷三種成分的相對(duì)保留時(shí)間分別約為8.1、10.5、16.1 min，能夠達(dá)到基線分離，分離度分別為2.8、4.1、3.8；回收率分別為100.43%、100.34%、100.32%；線性范圍分別為0.660～21.200、0.486～15.560、0.480～15.200 μg。結(jié)論 HPLC測(cè)定法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為地錦草的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

地錦草；蘆丁；異槲皮苷；紫云英苷；高效液相色譜法

地錦草為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或班地錦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中醫(yī)、維醫(yī)常用藥材，藥用價(jià)值高，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃功效，可用于治療痢疾、泄瀉、咯血、尿血，便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸［1-3］。其主要成分有黃酮類、三萜類、香豆素類、甾醇類、鞣質(zhì)及酚酸類化合物。目前，對(duì)地錦草中黃酮類成分的含量測(cè)定報(bào)道較多，2010版《中國(guó)藥典》也將槲皮素列為其含量檢測(cè)指標(biāo)，但未見同時(shí)測(cè)定地錦草中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量的報(bào)道，本研究通過參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-6］，對(duì)地錦草中的這3種成分進(jìn)行了含量測(cè)定，為地錦草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 島津LC-10A高效液相色譜儀，LC-10ATVP泵，SPD-10AVP可見紫外檢測(cè)器；浙大智達(dá)N2000雙通道色譜工作站；Satorius CP225D電子天平；Branson SB3200超聲波清洗器；金壇中大HH恒溫水浴鍋。

蘆丁對(duì)照品（購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：100080-200707）、異槲皮苷（購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：111809-201403）、紫云英苷對(duì)照品（購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20130420），乙腈、冰醋酸為色譜純，水為注射用水，其余試劑均為分析純。地錦草藥材（購自江蘇九泰醫(yī)藥有限公司）經(jīng)江蘇大學(xué)歐陽臻教授鑒定。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（5 μm，250× 4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸（20：80：0.15）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30oC；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣20 μl。理論板數(shù)：按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品適量，加乙睛-水溶液（90∶10）制成含蘆丁、異槲皮苷及紫云英苷均為0.1 mg/ml的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備 取地錦草藥材，粉碎，過篩，精密稱取2.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）回流至無色，棄去醚液，藥渣揮至無醚味，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.4線性關(guān)系的考察 精密吸取不同濃度的對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程。

1.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度的混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，考察其精密度。

1.2.6供試液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試液樣品，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算每一成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），觀察其在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性情況。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一份藥材樣品6份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)步驟操作，測(cè)定，計(jì)算樣品中各成分的含量以及RSD。

1.2.8回收率測(cè)定 精密稱取已知含量的樣品6份約1.0 g，分別加入蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品溶液，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下步驟處理，得供試品溶液。進(jìn)樣，計(jì)算各成分的回收率情況。

1.2.9樣品測(cè)定 分別精密稱取不同批次的地錦草藥材，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作、測(cè)定，計(jì)算藥材中各成分的含量。

2　結(jié) 果

2.1線性關(guān)系的考察 蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷三種成分的相對(duì)保留時(shí)間分別約為8.1、10.5、16.1 min左右，能夠達(dá)到基線分離，分離度分別為2.8、4.1、3.8。蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見表1。蘆丁在0.660～21.200 μg、異槲皮苷在0.486～15.560 μg、紫云英苷在 0.480～15.200 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2精密度試驗(yàn) 各成分的精密度良好，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的RSD分別為1.24%、1.43%、1.34%。

2.3供試液穩(wěn)定性試驗(yàn) 樣品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，各成分峰面積RSD分別為1.86%、1.63%、1.75%。

2.4重復(fù)性試驗(yàn) 6份供試品中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷平均含量分別為15.187、22.453、9.264 mg/g，RSD分別為1.48%、1.53%、1.79%。

2.5回收率測(cè)定 加樣回收率數(shù)據(jù)見表2。

2.6樣品測(cè)定 不同批次的地錦草藥材中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量數(shù)據(jù)見表3。

圖1　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品與供試品溶液的色譜圖

表2　蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3　不同批次樣品中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3　討 論

藥材中同時(shí)測(cè)定蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量的報(bào)道較多［7，8］，但大多采用梯度洗脫來對(duì)樣品進(jìn)行分離，本研究經(jīng)過篩選，采用等度洗脫來進(jìn)行含量測(cè)定，簡(jiǎn)化了方法，降低了對(duì)儀器的使用要求，并獲得了滿意的效果。

流動(dòng)相的選擇：筆者曾對(duì)甲醇-乙腈-水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水-冰醋酸等流動(dòng)相分別進(jìn)行系統(tǒng)篩選優(yōu)化，最后確定采用乙腈-水-冰醋酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并且對(duì)乙腈-水-冰醋酸的比例進(jìn)行了調(diào)整試驗(yàn)，最終在乙腈-水-冰醋酸（20∶80∶0.15）的條件下，三種指標(biāo)成分能夠很好的達(dá)到基線分離，出峰時(shí)間適中，且其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。樣品提取條件的選擇：在研究過程中分別進(jìn)行了不同溶劑（甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇）、不同提取方法（加熱回流、超聲提?。┖筒煌崛r(shí)間（0.5、1、1.5 h）的比較，最后確定以70%乙醇回流提取1 h較為合適，提取時(shí)間較短，有效成分不能完全提取，時(shí)間較長(zhǎng)則有效成分被損耗。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］. 2010版. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010： 118.

［2］王婷婷， 文今福， 金松南. 地錦草的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 33（8）： 629-632.

［3］謝 奇， 李治建， 斯拉甫·艾白， 等. 地錦草化學(xué)成分及其抗真菌作用的研究進(jìn)展［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2011， 30（7）： 880-883.

［4］呂鳳蓮，宋韶錦，方 彬. HPLC法測(cè)定地錦草中蘆丁的含量［J］. 齊魯藥事， 2010， 29（3）： 139-140.

［5］李 慧， 許 亮， 徐保利， 等. 5種地錦草藥材中總黃酮及3個(gè)酚酸類成分測(cè)定研究［J］. 中成藥， 2012， 34（ 7）： 1328-1332.

［6］黃 琪， 黃彩虹， 雷 鵬， 等. 地錦草藥材HPLC指紋圖譜及模式識(shí)別研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013，19（12） ： 95-98.

［7］邸 學(xué)， 谷麗艷， 王海波， 等. HPLC同時(shí)測(cè)定桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014， 20（15） ： 92-95.

［8］王 幻， 唐 輝， 王國(guó)軍， 等. HPLC測(cè)定天山花楸葉提取物中6種黃酮成分［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014，20（15） ： 58-61.

（2015-03-10收稿 2015-04-15修回）

（責(zé)任編輯 張亞麗）

Simultaneous determination of contents of Rutin， Isoquercitrin and Astragalin in Herba Euphorbia by HPLC

WANG Hui， QIAN Qiaozhen， WANG Jing， GU Yaqin， SHU Yan， and LI Hongyan. Jiangsu Jibeier Pharmaceutical Joint Stock Limited Liability Company， Zhenjiang 212009， China

Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for simultaneously determinating the contents of rutin， isoquercitrin， astragalin in Herba Euphorbia. Methods The chromatographic column was Kromasil C18 （5 μm， 250×4.6 mm）； mobile phase was composed of acetonitrile-water-glacial acetic acid （20:80:0.15）； detection wavelength （360 nm）； column temperature （30℃）.Current speed was 1.0 ml/min. Results Relative retention time of rutin， isoquercitrin， astragalin were 8.1， 10.5 and 16.1 respectively， which can achieve the baseline separation， and the separation degree were 2.8， 4.1， 3.8， respectively； recovery rate were 100.43%， 100.34% and 100.32%， respectively； linear range of methods were 0.660～21.200， 0.486～15.560， 0.480～15.200 μg. Conclusions HPLC was simple， accurate and repeatable， and may provide the basis for quality control of Herba Euphorbiac.

Herba Euphorbia； Rutin； Isoquercitrin； Astragalin； high performance liquid chromatography

LI Hongyan， E-mail: lhy707@126.com

R284.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.09.009

汪 慧，本科學(xué)歷，工程師，E-mail： 5062342765@qq.com

212009 鎮(zhèn)江，江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司

酈紅巖，E-mail： lhy707@126.com