劉曉瑜 馬玉超

（北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083）

抗耐藥細菌藥用植物內(nèi)生菌的篩選與鑒定

劉曉瑜 馬玉超

（北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐頭孢霉素大腸桿菌和耐亞胺培南銅綠假單胞菌在醫(yī)院臨床治療中引起的嚴重感染，極大地危害著人類身體健康。旨在從植物組織中分離和篩選高活性的拮抗上述耐藥細菌的內(nèi)生菌株。從分離自22種藥用植物組織的197株內(nèi)生菌中，經(jīng)過兩步篩選獲得18株對MRSA有拮抗作用的菌株，未篩選到對耐頭孢霉素大腸桿菌和耐亞胺培南銅綠假單胞菌有拮抗作用的菌株；經(jīng)16S rRNA序列分析，其中8株為鏈霉菌屬，6株為芽孢桿菌屬，4株為假單胞菌屬；對抑菌效果較強的5株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液對MRSA的抑菌效果，其中QN1和CF2的發(fā)酵液對MRSA有很好的抑制效果。

植物內(nèi)生菌；抑菌活性；耐藥細菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

抗生素藥物通常通過干預至關(guān)重要的代謝途徑阻止或破壞致病性細菌的生長，治療由細菌引起的傳染性疾病［1］。大多數(shù)抗生素都有高目標的具體機制，通過干擾一個特定的細胞功能，如細胞壁合成、蛋白質(zhì)或RNA合成、DNA復制或能量代謝等來發(fā)揮作用［2］。抗生素被廣泛應用于人類和動物的疾病治療，導致耐藥病原菌株的增加。耐藥病原菌產(chǎn)生的主要原因是這些菌株能夠合成抵抗抗生素的物質(zhì)，或在生物膜表面形成多糖和蛋白質(zhì)的水合矩陣［1］，或通過遺傳適應來克服易感性［4］等。

耐藥菌感染已成為危害人類健康的嚴重問題［5］，特別是耐藥性的革蘭氏陰性桿菌，如耐頭孢霉素大腸桿菌［6］、耐亞胺培南銅綠假單胞菌［7］和革蘭氏陽性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，在臨床治療中的檢出率最高，它們引起的嚴重感染，是醫(yī)院臨床治療的難點之一。每年有超過25 000個病人死于多重耐藥細菌的感染，在醫(yī)療保健環(huán)境中，如醫(yī)院或療養(yǎng)院，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是引起血液感染、肺炎和手術(shù)部位感染的主要原因，其通過各種機制對傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺類大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素均表現(xiàn)出高度耐藥性［8］，從而導致死亡率和住院費用的增加［9］。對頭孢菌素、氟喹諾酮類耐藥是以大腸桿菌為代表的腸桿菌科細菌的主要特征［6］。銅綠假單胞菌具有多重耐藥機制，亞胺培南是大量使用的廣譜抗菌藥物，其耐藥率逐漸上升，耐亞胺培南銅綠假單胞菌是醫(yī)院中分離較多的較為常見的耐藥細菌之一［7］。

近年來，由于世界范圍內(nèi)抗感染治療領(lǐng)域中細菌耐藥性問題越來越嚴峻以及新型感染性疾病的不斷涌現(xiàn)，尋求和開發(fā)新的微生物資源，對新型抗生素的發(fā)現(xiàn)和耐藥性感染性疾病的治療具有重大的現(xiàn)實意義。隨著土壤微生物資源的日趨枯竭，人們開始尋求新的微生物生境。微生物定殖在植物體內(nèi)與其長期協(xié)同進化，使得植物內(nèi)生菌形成了不同于土壤微生物的代謝途徑，產(chǎn)生大量化學結(jié)構(gòu)新穎、抑菌效果較好，或有特殊作用的生物活性物質(zhì)［10］。從藥用植物這樣一個特殊的生態(tài)位中分離得到的內(nèi)生菌，很有可能產(chǎn)生植物相關(guān)天然藥物，如生物堿、甾體、萜類、醌類和木脂素等［11］，以利于開發(fā)新型抗生素和天然活性產(chǎn)物。本研究從不同環(huán)境采集的藥用植物中分離得到數(shù)量繁多的內(nèi)生菌，對其進行抗MRSA、耐頭孢霉素大腸桿菌、耐亞胺培南銅綠假單胞菌的篩選，得到的拮抗菌株進行菌株鑒定，對抑菌效果強的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液抑菌活性，旨在為后續(xù)分離和提取對耐藥細菌有抑制效果的抗生素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 22種藥用植物材料：采集自湖南衡山的金錢松（Pseudolarix amabilis （Nelson）Rehd）、杜鵑（Rhododendron simsii Planch）、崖爬藤（Tetrastigma formosanum（Hemsl.）Gagnep.）、山 海棠（Begonia yunnanensis）、虎杖（Reynoutria japonica Houtt.）、南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）、菊葉三七（Gynura japonica）、蛇足石杉（Huperzia serrata（Thunb. ex Murray）Trev.）、野菊花（Dendranthema indicum（Linn.）Des Moul.）、鉤腺大戟（Euphorbia sieboldiana）和苦木（Picrasma quassioides）；采集自北京藥用植物園的紫蘇（Perilla frutescens）、野花椒（Zanthoxylum simulans Hance）、 構(gòu) 樹（Broussonetia papyrifera）、薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）和粗榧（Cephalotaxus sinensis）；采集自北京林業(yè)大學校園的貼梗海棠（Chaenomeles speciosa ）、紫荊（Cercis chinensis）、牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）、暴馬丁香（Syringa reticulata var. mandshurica）和君遷子（Diospyros lotus Linn.）；采集自鷲峰國家森林公園的薺苨（Adenophora trachelioides）。

1.1.2 供試菌株 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus T1959）、耐亞胺培南銅綠假單胞菌（I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa F1 029）和耐三代頭孢霉素大腸桿菌（Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli N800）均來自北京大學第三醫(yī)院。

1.1.3 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為：（1）TWYE培養(yǎng)基［12］：酵母提取物0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2-7.4。（2）GA培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，天門冬酰胺1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2-7.4。（3）ISP2培養(yǎng)基［13］：酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡糖糖4 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2-7.4。（4）LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2。（5）MS培養(yǎng)基（鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基）［14］：大豆蛋白胨12 g，甘露醇20 g，CaCO32.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。（6）芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基［15］：右旋葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.8。

1.1.4 主要試劑和儀器 革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒購自Bio-tek OMEGA，PCR擴增相關(guān)試劑購自大連寶生物工程有限公司，引物由Invitrogen公司合成，測序服務由北京諾賽基因組研究中心有限公司提供。PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)分別為Bio-Rad PCR儀和上海Tocan360凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 植物內(nèi)生菌的分離 將植物組織樣品室溫風干48 h后，進行五步法表面消毒［14］，用組織塊法和液氮研磨梯度離心法［16］將植物組織和懸浮液放置在GA和TWYE 兩種分離培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3-6周。挑取不同形態(tài)菌落在ISP2培養(yǎng)基上純化，然后通過菌落和顯微鏡下菌絲體特征，剔除相同的菌株。純化后的菌株用15%的甘油，-80℃保存。

1.2.2 拮抗內(nèi)生菌的篩選 挑取3種指示菌單菌落分別接種于液體LB培養(yǎng)基中，180 r/min、28℃震蕩培養(yǎng)過夜。以100 mL培養(yǎng)基中加入100 μL菌液的比例，向融化后冷卻至40℃的LB培養(yǎng)基中加入指示菌菌液，充分搖勻后倒平板，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，每個平板接種8個內(nèi)生菌，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察內(nèi)生菌對每種指示菌的抑制情況。若內(nèi)生菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈，說明此內(nèi)生菌對該指示菌有抑制效果。

對初篩獲得的內(nèi)生菌用劃線法再進行一次抑菌活性檢測，以便觀察記錄抑菌效果強弱。用劃線法分別在LB培養(yǎng)基平板的兩邊接種兩種內(nèi)生菌，做好標記，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待內(nèi)生菌長出，在平板中間空白處分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌，劃線要盡量接近兩側(cè)的內(nèi)生菌菌落，劃好線后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時觀察培養(yǎng)基內(nèi)指示菌生長情況。若指示菌在接近內(nèi)生菌的區(qū)域內(nèi)未長出菌落，說明該內(nèi)生菌對此指示菌有抑制作用，抑菌效果強弱以抑菌帶（未長出指示菌的區(qū)域）大小表示，抑菌帶＞8 mm表示抑菌效果強，抑菌帶5-8 mm表示抑菌效果中等，抑菌帶2-5 mm表示抑菌效果弱。

1.2.3 拮抗菌株鑒定 采用16S rRNA基因的PCR擴增和測序分析法對篩選獲得的拮抗內(nèi)生菌進行菌種鑒定。以拮抗菌株的基因組DNA為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和1492r（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）［17］為引物進行50 μL反應體系的PCR擴增。體系中包含0.25 mmol/L dNTPs，1×Buffer，上下游引物各1 μmol/L，1.25 U的rTaq酶，5-100 ng的DNA模板。擴增條件：94℃變性4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃2 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物送至諾賽公司測序后，用DNAMAN軟件進行拼接，得到的序列提交到http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/［18］進行序列分析，然后用MEGA5.0軟件［19］中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液活性檢測 對篩選得到的抑菌效果強的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液活性。挑取拮抗菌單菌落于ISP1液體培養(yǎng)基中28℃恒溫震蕩培養(yǎng)2 d，獲得種子液。以5%的比例加到100 mL/500 mL的1.1.3中所述相應發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)5 d。將金黃色葡萄球菌以1.2.2的方法混勻倒板，用打孔法檢測發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性。發(fā)酵液10 000×g 4℃離心2 min后，取上清用0.22 μm的無菌濾膜過濾除菌。用5 mm打孔器打孔，加入60 μL內(nèi)生菌發(fā)酵液，以未接菌的液體培養(yǎng)基做對照。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，觀察抑菌效果。若有抑菌效果，用直尺測量3孔培養(yǎng)基上每個孔的抑菌圈直徑，取平均值計算抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生菌的分離

從22種藥用植物中共分離得到197株內(nèi)生菌，其中從杜鵑中分離得到22株、虎杖中分離得到18株、金錢松中分離得到16株、野菊花中分離得到14株，這4種植物分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量最多（表1）。在完全相同的分離條件下，不同的藥用植物材料分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量不同，這與植物體內(nèi)定殖的內(nèi)生菌種類和分離得到內(nèi)生菌的難易程度有關(guān)。與其他植物相比，從君遷子、紫荊和薺苨中只分離得到少數(shù)內(nèi)生菌，推測可能試驗所用的分離方法不太適宜這些植物，使得部分內(nèi)生菌未釋放出來。

2.2 拮抗菌株篩選

本試驗用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐亞胺培南銅綠假單胞菌和耐三代頭孢霉素大腸桿菌對分離得到的197株植物內(nèi)生菌進行抑菌活性篩選，得到18株對金黃色葡萄球菌有抑制效果的內(nèi)生菌（圖1-A，圖1-B），沒有篩選到對銅綠假單胞菌和大腸桿菌有效果的菌株，這些拮抗內(nèi)生菌分別來自13種不同的藥用植物，其中以構(gòu)樹、牡丹、粗榧和蛇足石杉中得到的拮抗菌居多。

用平板對峙試驗檢測初篩獲得的18株內(nèi)生菌的抑菌活性，以耐藥性金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌為指示菌，檢測每種內(nèi)生菌的抑菌活性強弱（圖1-C）。獲得試驗結(jié)果統(tǒng)計（表2）顯示，其中有7株對MRSA有較強抑制效果，5株抑制效果中等，6株抑制效果較弱。

表1 197株植物內(nèi)生菌的統(tǒng)計結(jié)果

圖1 內(nèi)生菌對耐藥細菌的抑菌效果

表2 18株內(nèi)生菌對MRSA的拮抗活性

2.3 菌株鑒定

用Omega試劑盒提取18株拮抗菌的DNA，用16S rRNA 基因的通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送樣測序，將所測序列拼接后提交到http：// eztaxon-e.ezbiocloud.net/進行同源性比對分析，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對18株拮抗菌進行種屬鑒定，其中8株為鏈霉菌屬，6株為芽孢桿菌屬，4株為假單胞菌屬（表3，圖2）。

2.4 發(fā)酵液活性檢測

從中選出5株抑制效果較強的菌株（QN1、CF2、MD1、GS9和SZSS7）進行發(fā)酵液抑菌活性檢測，僅有QN1和CF2菌株發(fā)酵液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抑菌活性，抑菌直徑分別為2.8 cm（圖1-D）和2.1 cm。另外3個菌株的發(fā)酵液未檢測到活性，可能是發(fā)酵液中活性物質(zhì)的濃度過低或發(fā)酵條件不適宜，有待進一步深入研究。

表3 菌株鑒定結(jié)果

3 討論

抗生素類藥物在臨床上的廣泛使用導致許多致病菌對抗生素類藥物產(chǎn)生了多重耐藥性，特別是耐藥性的革蘭氏陰性桿菌，如耐頭孢霉素大腸桿菌、耐亞胺培南銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的嚴重感染，是醫(yī)院臨床治療的難點之一，極大地危害著人類的健康［21］。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌于1961年首次在英國發(fā)現(xiàn)。50多年來，它在臨床的檢出率越來越高。萬古霉素被公認為是目前最有效的抗生素，但耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌也于1997年在日本臨床分離出來［22］。隨著耐藥菌株的逐漸增多及其耐藥性的不斷增強，現(xiàn)有抗生素的臨床治療效果受到了嚴重的限制，尋找和開發(fā)新型抗生素資源勢在必行。

植物內(nèi)生菌因其能產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤物質(zhì)、抗感染活性物質(zhì)、植物生長促進劑和一些酶類而被廣大研究者作為篩選新型活性物質(zhì)的菌株。本研究從湖南衡山和北京郊區(qū)采集的22種藥用植物中分離得到197株內(nèi)生菌，從紫蘇、野花椒、鉤腺大戟和巖爬藤這4種植物中分離得到的內(nèi)生菌目前尚未有文獻報道，這些內(nèi)生菌大大豐富了內(nèi)生菌資源，可以進一步進行多樣性分析并作為其他功能篩選的菌株資源。

16S rRNA序列分析顯示，篩選得到的18株拮抗菌主要為鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，這3個屬的菌株具有很強的抑菌活性，在許多文獻中均有報道。菌株鑒定結(jié)果顯示，很多拮抗內(nèi)生菌是同一屬內(nèi)菌株，但由于分離植物的不同，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物很有可能不盡相同，還需要進一步研究。

目前，對于MRSA的治療主要依賴于有機大分子消毒劑Akacid、帶電金屬有機聚合物和傳統(tǒng)抗生素生物結(jié)合來發(fā)揮作用。Akacid是高度有效的全新消毒殺菌物質(zhì)，能有效殺滅細菌、病毒、真菌等有害微生物，并且無毒副作用［23］；帶電金屬有機聚合物表現(xiàn)出協(xié)同效應能夠抑制MRSA的β-內(nèi)酰胺酶活性，同時降解細菌細胞［24］。張守村等［25］在新疆苦豆子Sophora alopecuroides中篩選到一株抗MRSA的內(nèi)生細菌黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens，而本試驗從多種藥用植物中篩選得到抗MRSA的鏈霉菌和芽孢桿菌，為篩選新型抗MRSA的活性物質(zhì)提供了豐富的菌種資源。

在檢測發(fā)酵液抑菌活性試驗中只有QN1和CF2菌株對MRSA有抑菌活性，另外3個菌株的發(fā)酵液未檢測到活性，可以再設計不同的發(fā)酵條件，使其他菌株將抑菌活性物質(zhì)釋放出來。試驗后期將進行抑菌活性物質(zhì)的大量發(fā)酵和分離純化，從而分析其組成成分和化學結(jié)構(gòu)，并檢測其在不同pH、不同溫度、紫外線照射等環(huán)境下的穩(wěn)定性。將純化出來的抑菌活性物質(zhì)與現(xiàn)用治療MRSA藥物進行分析，比較二者的強弱關(guān)系。同時可以尋找和研究控制抑菌活性物質(zhì)表達的基因［26，27］，以便通過基因工程手段大量合成。對獲得的產(chǎn)物進一步進行毒性檢測，研究是否會對動植物造成損害，為新型藥物的開發(fā)奠定基礎。

4 結(jié)論

本試驗從22種藥用植物中分離得到197株內(nèi)生菌，采用平板對峙試驗篩選得到18株對MRSA有拮抗作用的菌株，未篩選到對耐頭孢霉素大腸桿菌和耐亞胺培南銅綠假單胞菌有拮抗作用的菌株。經(jīng)16S rRNA序列分析，其中8株為鏈霉菌屬，6株為芽孢桿菌屬，4株為假單胞菌屬。選取抑菌效果強的5株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中QN1和CF2的發(fā)酵液對MRSA有很好的抑制效果。

圖2 內(nèi)生拮抗菌與相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

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（責任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of Antagonistic Endophytes Against Drug-resistant Bacteria from Medicinal Plants

Liu Xiaoyu Ma Yuchao
（College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）， Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli and I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa have caused severe infection in clinical therapy and greatly endanger human health. The aim of this study is to isolate and screen highly active antagonistic endophytes against drug-resistant bacteria from medicinal plant. After two-step screening， 18 strains have antagonistic effect on MRSA were obtained from 197 strains isolated from 22 medicinal plants， none of the strains has antagonistic effect on Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli and I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa；16S rRNA sequence analysis showed that eight strains belong to Streptomyces， six strains belong to Bacillus， and four strains belong to Pseudomonas. Five strains which have strong anti bacterial activity were chosen for fermentation， and the fermented liquid of QN1 have strong inhibition effect on MRSA.

endophytes；antibacterial activity；drug-resistant bacteria；Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.022

2014-08-31

國家林業(yè)局公益項目（201304409），北京市科技新星項目（2011033），國家自然科學基金項目（J1103516）

劉曉瑜，女，碩士研究生，研究方向：植物內(nèi)生菌的抑菌活性研究；E-mail：liu.xiaoyu1991@163.com

馬玉超，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源開發(fā)利用；E-mail：mayuchao@bjfu.edu.cn