鄒修文，楊啟源，盛家榮

(廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西 南寧 530001)

八角是我國(guó)珍貴經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，在我國(guó)南方地區(qū)具有悠久的栽培和應(yīng)用歷史，廣西是中國(guó)乃至全球最大的八角主產(chǎn)區(qū)，其品質(zhì)優(yōu)良，被稱(chēng)為“世界八角之鄉(xiāng)”[1]。八角又稱(chēng)“八角茴香”，含豐富的天然活性成分八角茴香油﹑有機(jī)酸﹑八角茴香油樹(shù)脂﹑黃酮﹑倍半萜內(nèi)酯﹑多糖﹑木脂素類(lèi)等[2]。八角的研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[3-10]，八角果﹑莖﹑葉中均含有多糖[11-13]，但關(guān)于八角葉多糖的最佳提取工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。做好八角的研究開(kāi)發(fā)，增加八角的高附加值，對(duì)廣西經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。本文以粗多糖提取率為考察指標(biāo)，采用水提醇沉法提取八角葉多糖，通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化影響粗多糖產(chǎn)率的主要因素，為八角葉多糖的深入研究與開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑及儀器

原料：八角葉采自廣西壯族自治區(qū)北流市西埌鎮(zhèn)大車(chē)村；試劑：D-葡萄糖（化學(xué)純），無(wú)水乙醇﹑丙酮﹑苯酚﹑硫酸（均為分析純）。

儀器：DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，ME203E 型電子天平，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，RV 10 basic 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵，DT5-2 型低速臺(tái)式離心機(jī)，722S 型可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)L9(34)正交表[14]，選擇提取時(shí)間﹑料液比﹑提取溫度和提取次數(shù)4 個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 八角葉多糖提取因素水平

1.2.2 八角葉多糖的提取

將八角葉清洗干凈﹑烘干﹑粉碎 ，準(zhǔn)確稱(chēng)取9 份八角葉干粉，每份12.000g，按正交實(shí)驗(yàn)表下的因素水平條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。水煮至規(guī)定時(shí)間后，放冷，離心（4000r·min-1×3min），取上清液，減壓濃縮至20mL，加4 倍體積無(wú)水乙醇沉淀多糖，置于冰箱中靜置過(guò)夜，抽濾，分別用無(wú)水乙醇﹑丙酮洗滌2～3 次，60℃下烘干，得固體粉末，稱(chēng)重，計(jì)算粗多糖提取率。1.2.3 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖[13]

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確量取苯酚5.000g，用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 棕色容量瓶，稀釋至刻度，即得5.0%苯酚溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖0.025g，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，稀釋至刻度，即得100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0﹑10.0﹑15.0﹑20.0﹑25.0﹑30.0﹑35.0mL 于7 個(gè)50mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得10﹑20﹑30﹑40﹑50﹑60﹑70μg·mL-17 個(gè)不同濃度對(duì)照品系列溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：準(zhǔn)確移取7 個(gè)不同濃度對(duì)照品系列溶液1.0mL 于20mL 干燥具塞試管，分別加入1.0mL 5%苯酚溶液，冰水浴條件下再分別加入5.0mL 濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱25min，稍冷卻，冰水浴條件下再加入10mL 蒸餾水，待冷卻至室溫，用722S 型可見(jiàn)分光光度計(jì)在484nm 處測(cè)定其吸光度A。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并建立回歸分析方程。

3）多糖含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取八角葉粗多糖0.011g 于50mL 燒杯，加入1mol·L-1H2SO42 mL，加熱水解2h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶，稀釋至刻度，即得樣品液。準(zhǔn)確量取1.0mL 樣品液3 份置于20mL 干凈具塞試管，分別加入1.0mL 5.0%苯酚溶液，冰水浴條件下再分別加入5.0mL 濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱25min，稍冷卻，冰水浴條件下再加入10mL 蒸餾水，待冷卻至室溫，用722S 型可見(jiàn)分光光度計(jì)在490nm 處測(cè)定其吸光度A。根據(jù)測(cè)定結(jié)果和回歸分析方程，計(jì)算八角葉中多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)

以L(fǎng)9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇提取時(shí)間﹑料液比﹑提取溫度和提取次數(shù)等4 個(gè)主要影響因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2 極值R 可以看出4 個(gè)因素對(duì)粗多糖提取率影響的主次順序是D＞A ＞B ＞C，即主要影響因素是提取次數(shù)，其次是提取溫度﹑料液比﹑提取時(shí)間，并得出該正交實(shí)驗(yàn)的最佳組合為D2A3B3C2，即提取次數(shù)為2 次，提取溫度為75℃，料液比為1∶50，提取時(shí)間為3h。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照最佳工藝條件進(jìn)行3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，粗多糖提取率分別為13.08%，12.63%，12.89%，其平均值為12.87%，驗(yàn)證結(jié)果比較穩(wěn)定，與正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

根據(jù)1.2.3 所測(cè)得的葡萄糖對(duì)照品系列濃度的吸光度（表3），對(duì)表3 的數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得到回歸方程：A=0.06229+0.00864C，R=0.99837，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 葡萄糖對(duì)照品系列濃度的吸光度結(jié)果

圖1 葡萄糖對(duì)照品系列濃度的吸光度數(shù)據(jù)線(xiàn)性回歸分析

2.4 多糖含量的測(cè)定

最佳工藝條件下，八角葉粗多糖提取率為12.87%，根據(jù)1.2.3 所測(cè)得的八角葉粗多糖樣品的吸光度結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)2.3 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程及以下公式計(jì)算八角葉粗多糖中多糖的含量[15]：

其中：W樣為八角葉粗多糖中多糖的含量，%；100 為所配成樣品溶液的體積；C樣為由回歸方程計(jì)算得到的樣品濃度，μg·mL-1；0.91 為多糖的校正系數(shù)[16]；106為單位轉(zhuǎn)換因子；m樣為配成樣品溶液稱(chēng)取的粗多糖樣品質(zhì)量。

根據(jù)所測(cè)得樣品吸光度，代入回歸方程計(jì)算得出樣品濃度，進(jìn)而代入以上公式，計(jì)算得出八角葉干粉中多糖的含量，結(jié)果列于表4。

表4 樣品的吸光度及多糖含量結(jié)果

3 結(jié)論

采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了水提醇沉法提取八角葉粗多糖的工藝條件，提取八角葉粗多糖的最佳工藝條件為：提取次數(shù)為2 次，提取溫度為75℃，料液比為1∶50，提取時(shí)間為3h。在最佳工藝條件下，八角葉粗多糖提取率為12.87%，其多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，粗多糖中多糖含量為28.22%。八角葉多糖中還含有蛋白質(zhì)﹑小分子雜質(zhì)等物質(zhì)，需要進(jìn)一步進(jìn)行脫蛋白﹑除小分子雜質(zhì)及過(guò)柱等才能得到較純的單一組分，這些還有待于進(jìn)一步深入研究。

[1] 陸小鴻.“植物味精”八角[J].廣西林業(yè)，2014(3)：26-28.

[2] 趙秀玲.八角茴香天然活性成分最新研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012(19)：370-376.

[3] Lee A Y, Kim H S, Choi G, et al. Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Active Compounds from the Fruit of Illicium verum by Using Response Surface Methodology[J].Food Analytical Methods, 2014：1-10.

[4] Cai M, Luo Y, Chen J, et al. Optimization and comparison of ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted extraction of shikimic acid from Chinese Illicium verum [J].Separation and Purification Technology, 2014：375-379.

[5] Cai M, Guo X, Liang H, et al. Microwave-assisted extraction and antioxidant activity of Illicium verum oil from Illicium verum Hook. f.[J]. International Journal of Food Science ffamp;Technology, 2013, 48(11)：2324-2330.

[6] 韋靜，李芳耀，楊新平，等.容縣八角葉中揮發(fā)油成分氣質(zhì)聯(lián)用分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011(24)：58-61.

[7] 張俊巍，丁先露，張連富.小花八角葉精油化學(xué)成分的研究[J].中藥材，1994(12)：27-28.

[8] 張俊巍，張連富，丁先露.大八角葉精油化學(xué)成分的研究[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996(2)：61-62.

[9] 莫麗玲，肖詞英，黃鎖義，等.八角葉總黃酮的提取及其捕獲自由基作用研究[J].中國(guó)野生植物資源，2011(1)：50-53.

[10] 易國(guó)富，龍永勛，陳全斌.八角葉黃酮苷元及其含量的測(cè)定[J].輕工科技，2013(7)：19-20.

[11] 莫基賀，盧麗菊，韋金穎，等.八角多糖體外抗活性氧自由基作用的研究[J].中國(guó)處方藥，2012(5)：46-50.

[12] 李金花，黃鎖義，農(nóng)石生.八角莖多糖的提取及含量測(cè)定[J].食品科技，2011(8)：176-178.

[13] 黃小強(qiáng)，許大春，趙國(guó)山.八角葉多糖提取及含量測(cè)定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(5)：479-480.

[14] 蔣秀紅，王霆，崔永霞，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制何首烏多糖提取工藝[J].河南中醫(yī)，2010(3)：246-247.

[15] 易艷波.榕樹(shù)籽多糖的提取﹑結(jié)構(gòu)分析及抗氧化﹑抗腫瘤活性研究[D].南寧：廣西師范學(xué)院，2013.

[16] 林穎，吳毓敏，吳雯，田庚元.天然產(chǎn)物中的糖含量測(cè)定方法正確性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1996(3)：5-9.